Sviluppo di un approccio combinato di terapia cellulare e genica per il trattamento della Epidermolisi Bollosa Giunzionale COL17A1 dipendente

Collagen 17 (COL17) is a transmembrane type II protein involved in genetic and autoimmune blistering skin diseases. Reduced levels or total absence of COL17 cause a subtype of Junctional Epidermolysis Bullosa (JEB), a group of rare genetic skin diseases characterized by insufficient anchoring of the epidermis to the dermis resulting in skin blistering, mucosal fragility, and increased risk of cutaneous carcinogenesis. This project aimed at developing a combined cell and gene therapy for such a disease. To this end, we developed a self-inactivating  retroviral vector (SIN-RV) in which the COL17A1 cDNA is under the control of the human elongation factor 1α short promoter (EF1α). A stable, GMP-compliant packaging cell line was established, and its performance in correcting JEB patients’ cells was analyzed. At best, 76% of transduction efficiency was achieved. However, despite the VCN being 11, the expression of COL17 was low, not comparable to the healthy donors. Contemporary to the SIN- RV, an RV vector carrying COL17A1 cDNA under the control of MLV long terminal repeat (LTR) promoter was studied, showing successful results in both the efficiency of transduction and the expression of COL17 in JEB keratinocytes with an average VCN of 3. The SIN-RV vector adopted in this project showed great results with other therapeutic genes, such as COL7A1 causative of Dystrophic Epidermolysis Bullosa. This suggests intrinsic COL17A1-related expression issues in the SIN-RV framework. A deep study of the SIN-RV-transduced clones revealed that 20% of the integrated sequences consisted of rearranged forms of the therapeutic gene. Interestingly, rearrangements involved not only the COL17A1 transgene but also the viral backbone. However, the presence of rearranged sequences only partially justifies the low expression of COL17 in transduced keratinocytes. A combination of events may explain this phenomenon. The analysis of splicing sites within the COL17A1 ORF suggests the presence of strong splice donor/acceptor pairs that may be responsible for the low expression of the transgene. More data are necessary for a full understanding of the role of splicing in the SIN-RV-COL17A1.

L’Epidermolisi Bollosa Giunzionale (JEB) è una malattia genetica rara causata dalla ridotta o anormale espressione del collagene 17. Tale patologia coinvolge principalmente la pelle e si caratterizza per l’insufficiente ancoraggio dell'epidermide al derma sottostante con conseguente formazione di vesciche cutanee, fragilità della pelle e delle mucose e aumento del rischio di carcinogenesi cutanea. Questo progetto mira a sviluppare un approccio combinato di terapia cellulare e genica per tale malattia. Per minimizzare il rischio di problemi di sicurezza associati all'uso di vettori RV, abbiamo sviluppato un nuovo vettore retrovirale auto-inattivante (SIN-RV) in cui il DNA complementare (cDNA) del gene COL17A1 è stato posto sotto il controllo del fattore di allungamento della traduzione umano 1α (EF1α). In conformità alle norme di buona fabbricazione, è stata creata una linea cellulare “packaging” responsabile dell’assemblaggio del vettore SIN-RV. L’efficacia del surnatante virale prodotto da questa linea packaging è stata testata su cellule primarie di paziente COL17A1-JEB. La più alta efficienza di trasduzione raggiunta si attesta al 76%. Tuttavia, nonostante nelle cellule si siano integrate in media undici copie di vettore virale, l'espressione del Collagene 17 risulta essere bassa, non paragonabile al Collagene 17 presente nelle cellule di donatori sani. Contestualmente, è stato studiato un vettore RV in cui il cDNA di COL17A1 è stato posto sotto il controllo del promotore LTR derivato dal virus della leucemia murina di Moloney. Contrariamente al vettore SIN-RV, questo vettore ha mostrato un efficace ripristino del collagene 17 nelle cellule di pazienti JEB. Il vettore retrovirale SIN-RV adottato in questo progetto ha mostrato ottimi risultati con altri geni terapeutici, come ad esempio il collagene di tipo 7, coinvolto nell’Epidermolisi Bollosa Distrofica. Questo suggerisce come le problematiche di espressione del COL17 siano intrinseche ed esclusive del vettore SIN-RV-COL17A1. Uno studio approfondito dei cloni trasdotti ha rivelato che il 20% dei cloni presenta forme ricombinanti del gene terapeutico. È interessante notare che sono stati rilevati eventi ricombinanti non solo all'interno del COL17A1, ma anche al di fuori del gene terapeutico. Tuttavia, la presenza di riarrangiamenti nel gene terapeutico giustifica solo in parte la bassa espressione di collagene 17 nei cheratinociti trasdotti. Solo una combinazione di eventi potrebbe spiegare questo fenomeno. L'analisi dei siti di splicing all'interno della sequenza del COL17A1 suggerisce la presenza di forti coppie donatore-accettore di splicing che potrebbero essere responsabili dei problemi relativi all’espressione del transgene. Ulteriori dati sono necessari per comprendere totalmente il ruolo dello splicing nel vettore SIN-RV-COL17A1.