Caratterizzazione preclinica in vitro di nuovi inibitori non peptidomimetici della glutatione trasferasi P1-1

Le glutatione trasferasi (glutatione S-trasferasi, GST) promuovono la detossificazione di numerose sostanze esogene ed endogene elettrofile tramite catalisi della loro coniugazione con glutatione ridotto. Alcune GST, tra cui la GSTP1-1, partecipano inoltre alla regolazione di processi quali l’apoptosi e la proliferazione cellulare mediante interazione con mitogen activated protein chinasi [Ruzza et al., 2009]. Alcune GST, in particolare la GSTP1-1, sono notoriamente sovraespresse in numerosi tumori umani, e tale sovraespressione concorre a conferire un fenotipo di poliresistenza a farmaci antineoplastici. Nel corso degli anni sono stati dunque identificati e studiati svariati inibitori di GST o profarmaci attivati da tali proteine; nessuno di essi, tuttavia, è attualmente in uso clinico per la terapia dei tumori [Ruzza et al., 2009; Sau et al., 2010]. Fra gli inibitori di GST ad oggi identificati si annoverano il 6-(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-iltio)esanolo (NBDHEX) e il suo analogo strutturale MC3181, entrambi inibitori potenti della GSTP1-1 umana e in fase di valutazione preclinica quali agenti antitumorali [Ricci et al., 2005; Pasello et al., 2011; De Luca et al., 2014]. Un primo obiettivo dell’attività svolta nell’ambito del Dottorato di Ricerca era l’ottenimento di informazioni circa la stabilità metabolica dei due candidati farmaci, considerata l’attuale assenza di informazioni a riguardo. Tale analisi è stata effettuata mediante l’utilizzo, quali fonti degli enzimi di biotrasformazione, di frazioni subcellulari epatiche microsomiali e citosoliche umane, murine, e di ratto. Sono state considerate in particolare le reazioni di ossidazione microsomiale mediata da enzimi richiedenti nicotinammide adenina dinucleotide fosfato ridotto (NADPH), di coniugazione con acido glucuronico, e di ossidazione citosolica mediata da enzimi adenina dinucleotide ossidato (NAD+)-dipendenti. I risultati ottenuti mediante cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC) e cromatografia liquida accoppiata a rivelatore spettrofotometrico a serie di diodi e spettrometria di massa tandem (LC-DAD-MS/MS) dimostrano come entrambi i composti in esame vadano incontro, in tutte le specie considerate, a glucuronidazione, con formazione di un solo prodotto di reazione, e ad ossidazione microsomiale richiedente NADPH, con formazione di almeno due metaboliti. L’NBDHEX, ma non l’MC3181, è soggetto inoltre ad ossidazione citosolica NAD+-dipendente mediata da alcol deidrogenasi, con formazione di un unico prodotto di reazione. Il glucuronide dell’NBDHEX è stato ulteriormente caratterizzato mediante analisi di risonanza magnetica nucleare. Lo studio ha messo in evidenza l’esistenza di differenze interspecie nella velocità di glucuronidazione di entrambi i composti, e, nel ratto, di differenze tra i due sessi nella velocità di glucuronidazione dell’MC3181 e di ossidazione citosolica dell’NBDHEX. Tra gli inibitori di GSTP1-1 ad oggi noti vi è anche l’antinfiammatorio-immunomodulatore sulfasalazina (salicilazosulfapiridina, SASP) [Ahmad et al., 1992], il quale, tuttavia, si mostra poco adatto all’utilizzo in vivo nella terapia dei tumori, principalmente a causa della scarsa biodisponibilità orale e della marcata instabilità metabolica, riconducibile per lo più alla presenza di un gruppo azoico [Klotz, 1985]. Una seconda parte del lavoro svolto durante il Dottorato di Ricerca ha avuto come obiettivo la valutazione in vitro di 30 nuovi analoghi strutturali della SASP quali potenziali inibitori della GSTP1-1 umana per il trattamento dei tumori. Tutti gli analoghi considerati (EML) si caratterizzano per la sostituzione del gruppo azoico tipico della SASP con un anello imidazolico. Ulteriori modifiche sono state apportate a carico della porzione sulfonamidica e/o aminosalicilica della SASP. Sette dei 31 analoghi studiati (EML340, EML277, EML259, EML337, EML357, EML279, ed EML338) esercitano un effetto inibitorio nei confronti dell’attività coniugativa della GST isolata da placenta umana (principalmente GSTP1-1) superiore a quello della SASP; il legame azoico non appare dunque essenziale ai fini dell’attività inibitoria nei confronti dell’enzima. In saggi di inibizione enzimatica basati sull’impiego delle proteine umane ricombinanti GST A1-1, M1-1 e P1-1, il composto EML337 mostra un’inibizione preferenziale nei confronti della GSTP1-1. EML277 ed EML340 esibiscono invece marcata selettività d’azione nei confronti della forma GSTM1-1. Infine, gli esteri EML259, EML337 ed EML339 dimostrano, in esperimenti preliminari in vitro, attività inibitoria sulla crescita delle linee di melanoma umano A375 e SK-MEL 23, esprimenti GSTP1-1 [Depeille et al., 2005; Hoey et al., 2009].