Oncogene c-KIT: promoter region and downstream effectors as novel therapeutic targets

Una delle promettenti strategie anticancro prevede il blocco delle funzioni di quei geni essenziali per la proliferazione cellulare. Tra questi geni c-KIT - V-Kit Hardy-Zuckerman 4 Feline Sarcoma Viral Oncogene Homolog – costituisce un interessante bersaglio. c-KIT codifica per un recettore tirosin chinasico coinvolto nella regolazione della crescita e proliferazione cellulare nonché della progressione di alcuni tumori. E’ stato confermato che la sua espressione è cruciale in quelle forme di leucemia, mastocitosi, tumore gastrointestinale stromale e tumore ai polmoni associate a mancata regolazione di c-KIT. Anche il più comune tumore alla pelle nel cane – mast cell tumor MCT – presenta mutazioni e/o sovraespressione di c-KIT. Per questo il cane è considerato un solido modello animale. In questo lavoro vengono studiate due strategie al fine di impedire l’attività proliferativa di questo oncogene. La prima di queste strategie si basa sull’induzione di strutture non canoniche del DNA nella regione promotoriale al fine di ostacolare l’espressione genica. Infatti, nella regione promotoriale del gene c-KIT sono state identificate due sequenze ricche in guanine (KIT1_man e KIT2_man). In questo lavoro caratterizziamo la regione promotoriale del gene nel cane in termini di sequenza e di equilibri conformazionali in condizioni fisiologiche. I nostri risultati dimostrano che le caratteristiche conformazionali della sequenza KIT1 nel cane sono confrontabili con quelle nell’uomo. Le due isoforme di KIT2 identificate nel cane presentano invece una diversa distribuzione di conformazioni rispetto alla sequenza KIT2 nell’uomo. Queste diversità permettono di considerare KIT1 e KIT2 due distinti bersagli e quindi i possibili ligandi per G-4 possono essere sintetizzati in modo da riconoscere preferenzialmente l’una o l’altra sequenza. A tal fine una libreria di composti di strutture chimiche diverse (derivati di antracene, antracenedione, indolo, chinolina, isochinolina, fluorenone e di diammidi eterocicliche) è stata testata per valutarne la capacità di legame a queste particolari sequenze G-4. All’interno di questa libreria sono stati selezionati 3 composti, due derivati dell’antracenedione (Bal1,5 e Bapl2,6) e uno dell’antracene (Bis1,8). Tecniche diverse - Fluorescent Intercalator Displacement, Fluorescence melting studies, titolazioni CD, Surface Plasmon Resonance e Polymerase Stop Assay – sono state usate per comprenderne l’interazione con le strutture G-4 di KIT. Dai risultati emerge che Bal1,5 lega efficientemente tutte le sequenze testate, mentre Bapl2,6 e Bis1,8 legano preferenzialmente le sequenze KIT2. Inoltre è stato registrato un livello simile di citotossicità e blocco della trascrizione di KIT nelle cellule trattate con Bal1,5. Nel secondo approccio, invece, gli effettori a valle di c-KIT vengono considerati come potenziali bersagli terapeutici. Tra questi effettori abbiamo studiato FER. Durante il 3° anno del mio Dottorato ho trascorso 7 mesi presso il Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (France) nel gruppo del Dr. P. Dubreuil. Lo scopo di questo progetto era quello di confermare la funzione onco soppressiva di FER. Per questo motivo sono stati usati fibroblasti da embrioni di topo MEFs alcuni nativi e altri privati del gene fer. Entrambe queste due tipologie di fibroblasti sono state immortalizzate con il retrovirus SV40. Silenziando il gene fer è stata osservata una crescita incontrollata dei fibroblasti nel test di inibizione di contatto. Ma al momento non è stato possibile spiegare questa osservazione a livello molecolare. Infatti non sono state osservate differenze nei meccanismi molecolari tra le cellule con fer e quelle in cui il gene è stato silenziato. In conclusione, i risultati qui presentati dimostrano che le strutture G-quadruplex a livello promotoriale costituiscono un promettente bersaglio al fine di prevenire la trascrizione dell’oncogene KIT. Per quanto riguarda FER, sono invece necessari ulteriori studi per avvalorare il suo ruolo onco soppressivo.