Mass spectrometry as an emerging tool for the detection of proteins in complex matrices: from untargeted to targeted analysis

Il mio dottorato di ricerca si è svolto in Mérieux NutriSciences, un’ azienda che fornisce servizi analitici. Durante il mio periodo di dottorato ho lavorato su tre progetti, il cui determinante comune era l'applicazione della spettrometria di massa (SM) all'analisi delle proteine. Lo studio principale riguarda la SM applicata all'analisi degli allergeni alimentari. L'allergia alimentare è una patologia importante, dovuta a reazioni immunologiche che insorgono a seguito dell'esposizione di un soggetto ad allergeni proteici. Poiché ad oggi non esiste cura, per prevenire le reazioni allergiche i pazienti devono evitare di assumere alimenti contenenti allergeni. Nell'Unione Europea, 14 allergeni devono essere indicati sulle etichette degli alimenti se aggiunti intenzionalmente. Tuttavia, una delle principali cause di reazione allergica è rappresentata dalla contaminazione indesiderata degli alimenti con allergeni all'interno degli impianti di produzione. Anche piccole quantità di allergene possono scatenare gravi reazioni; dunque, per proteggere i consumatori sono necessari metodi analitici sensibili. Recentemente, i metodi basati sulla SM hanno ricevuto crescente attenzione per la quantificazione degli allergeni alimentari in matrici complesse. Nel presente studio viene descritto lo sviluppo di un metodo basato sulla SM per il rilevamento simultaneo di allergeni da uova, latte, arachidi e frutta secca in prodotti da forno. Il metodo si basa sull'identificazione di specifici peptidi generati dall'idrolisi enzimatica degli allergeni target ed impiega una tecnica chiamata Multiple Reaction Monitoring, in cui lo spettrometro di massa è utilizzato per acquisire selettivamente segnali derivanti da coppie di specifici valori m/z, corrispondenti a uno ione peptidico e ad uno dei suoi frammenti. Il metodo sviluppato consente di rilevare gli allergeni target in modo specifico e con sensibilità accettabile e può essere considerato una valida alternativa ad altre comuni tecniche analitiche, come l’ELISA e la PCR. Un secondo argomento trattato in questa tesi riguarda la beta-caseina bovina, una proteina polimorfica per la quale sono state identificate 12 varianti genetiche, fra cui le più comuni sono la A1 e la A2. Alcuni studi hanno suggerito una possibile associazione fra il consumo di beta-caseina A1 e l'eziologia di alcune malattie, tra cui l’ischemia cardiaca e il diabete. Alla base degli effetti causati dalla beta-caseina A1 ci sarebbe un peptide bioattivo con attività simil-oppiode, rilasciato da specifici enzimi proteolitici durante la digestione. Questo peptide, chiamato beta-casomorphin-7, viene generato solo a partire da alcune isoforme di beta-caseina, contenenti un'istidina in posizione 67, inclusa la variante A1. Al contrario, le varianti che possiedono una prolina in posizione 67, come la variante A2, non sarebbero in grado di generare il peptide beta-casomorphin-7. Sulla base di queste ipotesi, alcune aziende vendono ora il cosiddetto "latte A2", un tipo di latte contenente solo beta-caseina A2. In questo progetto di dottorato è stato sviluppato un metodo analitico LC-MS per discriminare il latte A2 dal latte commerciale, che tipicamente contiene una miscela di beta-caseina A1 e A2. Lo scopo finale è offrire ai produttori di latte uno strumento analitico per certificare che un latte etichettato come "latte A2" sia realmente tale, ed eventualmente in grado di identificare possibili frodi o contaminazioni. Infine, in questa tesi viene descritto un progetto che ha come oggetto l'enzima transglutaminasi (TGasi) di origine microbica. La TGasi catalizza la formazione di legami isopeptidici tra residui di glutammina e di lisina, determinando la formazione di cross-linking fra proteine. L'azione della TGasi può determinare cambiamenti significativi nelle proprietà fisico-chimiche delle proteine, portando a modifiche nella viscosità, nella stabilità termica e nella elasticità. Per questi motivi, la TGasi trova applicazione come additivo nell'industria alimentare. In questo studio, una specie di TGasi di origine microbica è stata caratterizzata e identificata applicando un approccio proteomico “bottom-up”. L'enzima identificato viene prodotto da un ceppo batterico diverso da quello più comunemente utilizzato nelle applicazioni industriali alimentari, denominato S. mobaraense. Infine, è stato sviluppato un metodo per la misurazione dell'attività enzimatica della TGasi mediante il saggio dell'idrossammato, che è ora diventato un servizio analitico offerto da Mérieux NutriSciences.