A formulation science perspective applied to combination vaccines: particles-based multiplex immunoassays for improved antigens characterization and rational design of adjuvants for tailored immunity to acellular pertussis vaccines

Riassunto: I vaccini sono prodotti complessi costituiti da diversi elementi tra i quali esiste un rapporto d’interdipendenza: la presenza concomitante di antigeni, adiuvanti, ed eccipienti è essenziale per garantire l'efficacia del prodotto finale. Gli adiuvanti sono spesso necessari per stimolare il sistema immunitario e aumentare l'immunogenicità di un vaccino composto di antigeni molto purificati: diventano perciò sempre più importanti nelle moderne formulazioni di vaccini. Le proprietà fisico-chimiche di tutti gli elementi e dell'intera formulazione e devono essere controllate prima dell'iniezione. Tuttavia, le tecniche analitiche ora disponibili spesso interferiscono con gli adiuvanti, e problemi di caratterizzazione sono incontrati. In questa tesi gli adiuvanti sono stati sfruttati con l'obiettivo di indagare la possibilità di migliorare la qualità e l'immunogenicità dei vaccini combinati, nei quali l'inclusione di più elementi antigenici contribuisce alla maggiore complessità del prodotto finale. In particolare, tre fattori di virulenza del batterio Gram negativo Bordetella pertussis (tossina della pertosse PT, emoagglutinina filamentosa FHA, e pertactina 69K) sono stati scelti come antigeni modello. I vaccini acellulari di pertosse (aP) attualmente autorizzati sono combinati con le tossine inattivate di difterite e tetano nel vaccino DTaP/TdaP, che è considerato la pietra miliare dei vaccini combinati. Questo vaccino è tipicamente adiuvato con sali di alluminio, noti per indurre prevalentemente una risposta immunitaria umorale che è stata associata con le recenti epidemie di pertosse segnalate in molti paesi. Ciò suggerisce che il vaccino esistente non sia ideale per fornire una protezione contro la malattia. Pertanto, un approccio basato sulle scienze farmaceutiche e focalizzato sugli adiuvanti è stato applicato per studiare il potenziale miglioramento dei vaccini acellulari di pertosse, attraverso lo sviluppo della caratterizzazione analitica e la razionale polarizzazione della qualità della risposta immunitaria. Sviluppo di saggi di caratterizzazione in vitro per vaccini combinati adiuvantati con idrossido di alluminio: La caratterizzazione analitica in vitro è necessaria per individuare le condizioni di formulazione ottimali che garantiscano l'integrità fisica, chimica e biologica di antigeni e adiuvanti. I metodi analitici ora in uso sono soprattutto adatti per la caratterizzazione di antigeni non formulati - richiedendo quindi il desorbimento completo dalla superfice degli adiuvanti a base di alluminio - e non sempre sono in grado di distinguere tra i singoli antigeni contenuti nei vaccini combinati. In questa tesi la tecnologia Luminex è proposta come proof of concept per lo sviluppo di un miglior metodo analitico per la caratterizzazione di vaccini. Questo metodo è basato sull'utilizzo di anticorpi specifici legati a microsfere magnetiche che sono univocamente riconoscibili tramite una firma digitale permettendo quindi l’identificazione simultanea dei rispettivi antigeni formulati nel vaccino. I vaccini combinati TdaP sono stati scelti come modello per sviluppare un saggio in grado di quantificare simultaneamente gli antigeni acellulari della pertosse (aP) e il loro grado di adsorbimento all’adiuvante. Questo saggio è direttamente applicabile al vaccino commerciale, evitando qualsiasi procedura laboriosa per la separazione degli antigeni dall’adiuvante. Una quantificazione accurata e riproducibile degli antigeni aP nel vaccino TdaP è stata ottenuta in un intervallo di concentrazioni compreso tra 0,78 e 50 ng/mL, fornendo informazioni sull'identità degli antigeni, la loro quantità e il grado di assorbimento alla superficie dell’idrossido di alluminio. Il metodo di caratterizzazione sviluppato sulla tecnologia Luminex ha la potenzialità di essere valutato come test di in vitro potency - permettendo idealmente la riduzione degli studi effettuati sugli animali. Valutazione in vivo di nuovi adiuvanti per migliorare i vaccini combinati contenenti aP: L'approccio di combinare gli antigeni di difterite, tetano e pertosse in un unico vaccino è diventato il fondamento dei programmi d’immunizzazione pediatrici e per adulti. Nonostante l’elevata copertura vaccinale, una riacutizzazione dei casi di pertosse è stata recentemente registrata in molti paesi, suggerendo che i vaccini attuali non possono fornire un’adeguata protezione di lunga durata. Diversi approcci sono stati proposti al fine di sviluppare vaccini in grado di indurre una risposta immunitaria più durevole e più adeguata contro la pertosse, tra cui l'uso di nuovi adiuvanti. I vaccini contro la pertosse ora autorizzati contengono sali di alluminio, che sono gli adiuvanti più comuni per uso umano. Inducendo principalmente risposte immunitarie umorali, i sali di alluminio non sono ideali per fornire protezione contro gli agenti patogeni che richiedono una risposta immunitaria cellulare, come ad esempio Bordetella pertussis. Pertanto, altri adiuvanti che stimolino l’induzione di cellule Th1 potrebbero essere più adeguati. In questo progetto, abbiamo provato tre diversi adiuvanti: l’emulsione MF59 - che induce una risposta mista Th1/2 - oppure la combinazione di un agonista del Toll-Like Receptor 4 (TLR4a) o del Toll-Like Receptor 7 (TLR7a) con idrossido di alluminio – che polarizzano la risposta verso il profilo Th1. Gli adiuvanti sono stati valutati per la loro capacità di migliorare le risposte immunitarie contro il vaccino TdaP contenente tre antigeni di B. pertussis: tossina della pertosse geneticamente detossificata (PT-9K/129G), emoagglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (69K). La rapida induzione di titoli anticorpali e la polarizzazione della qualità della risposta immunitaria indotte dagli adiuvanti qui esaminati sostengono pienamente la potenzialità di sostituire i sali di alluminio con adiuvanti alternativi che migliorino l’immunogenicità di vaccini combinati contenenti aP. Conclusioni: Complessivamente, i risultati raccolti suggeriscono la possibilità di modulare la qualità e l'efficacia di un vaccino complesso lavorando sulla componente adiuvante. Migliorare la caratterizzazione analitica dei vaccini e indirizzare una polarizzazione razionale della risposta immunitaria sono proposte come strategie efficaci da perseguire per lo sviluppo dei vaccini combinati della prossima generazione.