Discovery and characterization of new Ene-reductases

Sette nuove ene-reduttasi putative sono state identificate attraverso mezzi bioinformatici con un approccio di “genome mining” da diversi organismi: Galdieria sulphuraria (GsOYE), Chroococcidiopsis thermalis (CtOYE), Chloroflexus aggregans (CaOYE), Botryotinia fuckeliana (BfOYE1 and BfOYE4) e Aspergillus niger (AnOYE2 and AnOYE8). In particolare gli organismi fotosintetici (Galdieria, Chroococcidiopsis e Chloroflexus) e i fungi (Botryotinia e Aspergillus) sono, ad oggi, fonti di ene-reduttasi rimaste inesplorate. Per il clonaggio e l’espressione di tutte e sette le sequenze codificanti le proteine di interesse è stata utilizzata una strategia comune. Inizialmente tutte le proteine sono state espresse utilizzando come ospite E. coli BL21(DE3); con questa strategia, però, sovraespressione e buona solubilità sono state ottenute solo per quattro delle sette proteine, GsOYE, CtOYE, CaOYE e BfOYE1. Per le altre tre proteine è stata necessaria un’ulteriore ottimizzazione. La bassa solubilità di AnOYE2 e AnOYE8 e la scarsa espressione di BfOYE4 sono state affrontate utilizzando diverse strategie, come la diminuzione della temperatura e l’utilizzo di chaperonine ma anche l’utilizzo di altri ospiti per l’espressione proteica (P. pastoris). Per tutte e sette le proteine ricombinanti è stata condotta una caratterizzazione biocatalitica. Una volta dimostrata la loro attività come ene-reduttasi in vitro, sono stati determinati anche i parametri cinetici per i substrati preferiti da ciascun enzima. Nel laboratorio del Professor Kurt Faber dell’Università di Graz, sono state messe a punto bioconversioni per i due enzimi GsOYE e CtOYE, al fine di capirne il profilo di selettività nei confronti di substrati standard. Infine, è stata condotta anche una caratterizzazione biochimica che ha permesso di determinare la stabilità termica e la tolleranza a diversi pH dei nuovi enzimi identificati; per i quali è stata anche ottenuta la struttura tridimensionale. Nella tesi è discusso l’utilizzo degli enzimi nell’isomerizzazione NADH-indipendente di substrati con legami C=C non attivati e la loro successiva riduzione, così come gli sforzi per chiarire il meccanismo d’azione di questa nuova reattività scoperta solo di recente. Il lavoro presentato ha portato alla scoperta di nuove ene-reduttasi, ampliando così il pannello dei biocatalizzatori disponibili per la riduzione del doppio legame C=C ma anche per reattività biocatalitiche inaspettate.