Identification and functional characterization of human cytomegalovirus Surface exposed glycoproteins

Riassunto L’approccio di Reverse vaccinology applicato all’intero genoma del cytomegalovirus umano (HCMV), uno dei genomi più estesi all’interno della famiglia degli herpesviruses umani, ha portato all’identificazione di 94 ORF predette come codificanti per proteine di membrana o proteine secrete. La gran parte delle ORF selezionate non ha alcuna funzione assegnata pur rimanendo altamente conservata in tutti i ceppi conosciuti di HCMV. Tali ORF sono state inserite in vettori d’espressione eucariotici aggiungendovi una porzione C-terminale codificante per i tags His e myc. L’ analisi dettagliata riguardante le proprietà antigeniche dei prodotti proteici derivanti dalla trasfezione in cellule epiteliali e fibroblasti umane dei plasmidi in questione ha prodotto la selezione di 12 proteine virali. Questo lavoro di tesi è stato incentrato sull’ identificazione e caratterizzazione funzionale di due nuove glicoproteine presenti sulla membrana esterna di HCMV. Lo studio è diviso in due parti: in prima analisi, l’identificazione e la caratterizzazione di ORFX*; in seconda analisi l’identificazione e caratterizzazione di RL13 come Fc binding protein. Riguardo la prima parte del lavoro, l’attenzione è stata focalizzata sul prodotto genico di ORFX inzialmente identificata solo attraverso analisi in silico. Analisi biochimiche su ORFX prodotta in infezione e talvolta in trasfezione di cellule umane hanno portato i seguenti risultati: 1) ORFX è una proteina estesamente glicosilata 2) Vene prodotta nelle fasi tardive di espressione lungo il ciclo di replicazione virale, 3) è presente nel sito di assemblaggio virale (Assembly complex) in cellule infettate da HCMV, 3) è esposta sulla sua membrana esterna del virus,4) Viene secreta dalle cellule che la esprimono in maniera transiente come da predizioni. Queste osservazioni ci hanno guidato verso l’idea di cercare dei possibili partner proteici tra quelli conosciuti come presenti sull’envelope esterno virale. A tal proposito abbiamo riscontrato che gH veniva trasportato nella membrana plasmatica cellulare solo quando co-espressa con ORFX e viceversa. La Co-immunoprecipitazione di ORFX e gH da lisati di cellule infettate e trasfettate con i singoli geni ha rivelato la diretta interazione tra le due proteine identificando ORFX come parte di un complesso “gH based”. Questi risultati delineano un ipotetica funzione di ORFX come proteina potenzialmente implicata nell’ “escort” di gH e talvolta parte di un complesso virale possibilmente riconosciuto dall’host. Riguardo la seconda parte del lavoro di tesi, i risultati sono riguardanti l’identificazione due nuove “Fc binding proteins” codificate da HCMV :RL 12 e RL13. Quest’ultima è stata sottoposta a caratterizzazione biochimica nella sua forma ricombinante in termini di localizzazione intracellulare, studio del sito di legame per le Fc e abilità della proteina a promuovere l’internalizzazione cellulare delle IgG nel contesto dei meccanismi virali di immuno-evasione. *Nomi e sequenze proteiche sono attualmente sotto la revisione dell’ufficio brevetti NVD