Role of CYBR, a cytohesin binder and regulator scaffold protein, in cell-mediated immune response in vivo

Cybr (cytohesin binder and regulator) è una proteina adattatrice coinvolta nell’assemblaggio e nel reclutamento di complessi proteici associati con il trafficking intracellulare e la trasduzione del segnale. Grazie alla sua esclusiva espressione in cellule di origine ematopoietica, Cybr ha attirato l’attenzione come potenziale proteina chiave nei meccanismi molecolari che controllano le cellule del sistema immunitario. Cybr interagisce con i membri della famiglia delle citoesine attivanti gli ADP ribosylation factors (ARF), specialmente con citoesina-1, e regola l’adesione citoesina-1 mediata di LFA 1 a ICAM-1. La sua espressione è rapidamente regolata da molte citochine e da altri effettori solubili del sistema immunitario. Alcuni ruoli funzionali proposti per questa molecola sono la partecipazione nella formazione delle vescicole, nel trafficking endocitico, nella regolazione del signaling del TCR e nell’interazione tra cellule dendritiche e cellule T durante la presentazione dell’antigene. Al fine di caratterizzare il ruolo fisiologico di questa molecola in vivo, è stato creato un ceppo di topi deficienti per Cybr. Questi topi, nonostante un normale sviluppo del sistema immunitario, mostrano una ridotta o ritardata capacità di rispondere a diversi stimoli e in condizioni di stress. Questo progetto di ricerca si è prefisso di investigare la funzione biologica di Cybr nella risposta immunitaria cellulo-mediata nei confronti di tumori indotti dal complesso retrovirale costituito dai virus sarcomatogeno e leucemogeno murini di Moloney (M-MSV/MuLV, in seguito indicato come M-MSV). L’inoculo intramuscolare di M-MSV in topi C57BL/6 (B6) immunocompetenti causa lo sviluppo di sarcomi che regrediscono spontaneamente grazie ad una forte risposta immunitaria mediata principalmente da linfociti T citotossici (CTL) specifici per gli antigeni virali. Al contrario, topi Cybr-deficienti inoculati con M-MSV sviluppano tumori di dimensioni maggiori e che regrediscono più lentamente rispetto ai controlli. Per comprendere i motivi di questo diverso andamento, dopo l’inoculo del complesso retrovirale in topi Cybr-deficienti e wild type, sono stati caratterizzati a livello fenotipico e funzionale i linfociti presenti nei tumori, nei linfonodi drenanti e nelle milze al momento della massima crescita tumorale (giorni 11-15). Abbiamo riscontrato un ridotto numero di linfociti T CD4+ e CD8+ e di CTL antigene specifici nella popolazione infiltrante il tumore nei topi Cybr-deficienti. Tuttavia questa differenza si è ridotta alla fine del periodo analizzato. Inoltre, un ritardo simile è stato riportato nello sviluppo dell’attività litica nei CTL provenienti da topi Cybr-KO rispetto a topi wild type. Al contrario, linfociti T memoria wild type e Cybr-KO non hanno mostrato nessuna differenza in termini di attività litica. Complessivamente, questi dati indicano che la deficienza di Cybr ha un significativo impatto nell’attivazione delle cellule T naive e nella loro espansione dopo il priming, ma non definiscono se questa proteina influenzi maggiormente la fase di priming e/o adesione cellulare o il trafficking e la migrazione delle cellule del sistema immunitario. Per chiarire questi aspetti, sono stati trasferiti linfociti T naive provenienti da topi Cybr-KO/GFP o B6/GFP in topi RAG2-/-γc-/- inoculati con il complesso retrovirale. Questi topi mancano di cellule T, B e NK e non regrediscono spontaneamente i tumori M-MSV indotti. Nonostante l’infusione di cellule T, i tumori hanno continuato a crescere, indicando che le cellule T naive non sono state in grado di montare una risposta immune pienamente efficace in questo modello, un aspetto probabilmente dovuto ad un reclutamento e priming sub ottimali nei linfonodi, che sono risultati ipoplastici. Al fine di rispondere a questi quesiti biologici, topi B6 nu/nu atimici ricostituiti con tessuto midollare depleto di linfociti T provenienti da topi wild type o Cybr-KO e successivamente infusi con linfociti T naive o memoria provenienti da topi Cybr-KO/GFP o B6/GFP, dovrebbero costituire un modello sperimentale ottimale per investigare il ruolo di Cybr sia nel comparto T che nel comparto APC. Nell’insieme, i risultati ottenuti indicano che la deficienza di Cybr ha un significativo impatto nella risposta immune antigene-specifica, ma studi addizionali devono essere condotti al fine di definire con maggior precisione il ruolo di Cybr nella fase di priming e nel ritardo dello sviluppo dell’attività litica