Development of a microfluidic approach for the real-time analysis of autocrine and paracrine TGF-beta signaling

Il Trasforming Growth factor beta (TGF-beta) è una citochina multifunzionale che controlla differenti processi cellulari tra cui proliferazione, differenziamento, migrazione e apoptosi. Sebbene il TGF-beta controlli una varietà di processi biologici, la via di segnale è espressa in una maniera relativamente semplice. Il TGF-beta è secreto come complesso latente e richiede un'attivazione enzimatica per legare il suo recettore e mediare il segnale intracellulare. Il controllo temporale della via di segnale è essenziale per regolare il processo di embriogenesi e il mantenimento dell'omeostasi nel tessuto maturo. Disregolazioni della via di segnale sono associate a condizioni patologiche come fibrosi e carcinogenesi. La prima parte di questo lavoro è focalizzata sulla via di segnale di TGF-beta. Esponendo cellule integrate in una piattaforma microfluidica ad amministrazioni multiple e periodiche di TGF-beta, è stato identificato come differenti stimolazioni con TGF -beta sono associate a differenti dinamiche della via di segnale ed espressione di geni target. In particolare è stata focalizzata l' attenzione sulla proteina SMAD7, responsabile dell' inattivazione della via di segnale ed è stato dimostrato che l' espressione di SMAD7 è indipendente dalla frequenza di stimolazione con TGF-beta. Differenti risultati clinicamente rilevanti possono essere ottenuti controllando l'attivazione, durata e intensità  della via di segnale a livello intracellulare ed extracellulare, quindi, utilizzare come bersaglio la via di segnale di TGF-beta nel trattamento farmacologico di patologie epatiche costituisce un approccio innovativo. Nella seconda parte di questo lavoro, grazie all'utilizzo della tecnologia microfluidica è stato prodotto un dispositivo per analizzare alcuni aspetti del processo di fibrosi epatica in vitro. In questa piattaforma microfluidica il microambiente promuove l'accumulo di fattori profibrotici o antifibrotici in risposta a stimoli profibrotici o antifibrotici, secreti da differenti tipi cellulari, coinvolti nel processo di fibrosi epatica. E' stata valutata la produzione , attivazione e funzione di TGF-beta endogeno da cellule del microambiente epatico, con particolare attenzione su cellule stellate e macrofagi, che sono rispettivamente responsabili del processo fibrotico e infiammatorio. E' stato inoltre analizzato lo specifico effetto della glicoproteina di matrice Trombospondina-1 nell'attivazione del TGF-beta in forma latente. La Trombospondina-1 è incrementata nel siero di pazienti fibrotici, per questa ragione è stato valutato l'effetto della trombospondina-1 nell' attivazione del TGF-beta autocrino secreto dalle cellule stellate epatiche. E' stata inoltre analizzata la produzione di collagene mediata da TGF-beta in cellule epatiche e cellule stellate, rilevando come queste ultime producano collagene in risposta a TGF-beta endogeno o esogeno. La terza parte del lavoro si è focalizzata sullo sviluppo di un modello di epatocita umano derivato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piattaforme microfluidiche. Il protocollo di differenziamento è stato utilizzato per ottenere cellule epatiche funzionali e ottimizzato per l'ottenimento di cellule epatiche in cultura su matrici acellulari derivate dal processo di decellularizzazione di fegato. E' risaputo che il TGF-beta induce un effetto di rimodellamento della matrice extracellulare e la deposizione di collagene, tuttavia non è noto l'effetto che la matrice extracellulare induce sulle cellule durante il processo fibrotico. In tale contesto matrici decellularizzate di fegato umano sono state ottenute da donatore sano o paziente fibrotico per analizzare l'effetto della differente composizione della matrice extracellulare sulla secrezione di fattori endogeni mediata da cellule epatiche, rilevando un effetto sulla modulazione della produzione di TGF-beta.