INVOLVEMENT OF BIOGENIC ACTIVE AMINES IN MITOCHONDRIAL MEMBRANE PERMEABILIZATION AND PRO-APOPTOTIC FACTORS RELEASE

L'attivazione dell’apoptosi intrinseca è correlata alla permeabilizzazione delle membrane mitocondriali. Questo complicato processo, sebbene non sia stato ancora completamente compreso, può essere generalmente suddiviso in due fasi: la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale. In base alle condizioni sperimentali tali fasi possono essere collegate o indipendenti. Diversi componenti che regolano i suddetti processi sono attualmente in fase di studio, poiché si sono rivelati bersagli promettenti per il trattamento di numerose malattie, tra le quali in particolare il cancro. Infatti, il macchinario apoptotico mitocondriale nelle cellule tumorali è strutturalmente e funzionalmente diverso da quello delle cellule normali e quindi un gran numero di composti che hanno come target la transizione di permeabilità potrebbe per tale motivo esibire una selettività tumorale. In questo contesto, una famiglia di composti noti come amine biologicamente attive acquista un'importanza crescente. Queste amine, tra cui le più note sono spermina, spermidina, putrescina e agmatina, sono molecole policationiche a pH fisiologico, naturalmente presenti in quasi tutte le specie viventi, in cui esercitano un ruolo essenziale per la crescita e la differenziazione cellulare. È da notare che la via biosintetica delle poliamine è molto attiva nelle cellule tumorali e che concentrazioni elevate di poliamine sono spesso presenti in cellule tumorali in divisione ed in tessuti in proliferazione. Inoltre, la de-regolazione del metabolismo delle poliamine può indurre l'apoptosi. Per questi motivi, il loro ruolo primario nella regolazione della proliferazione e della morte cellulare ha portato gli scienziati a studiarne il ruolo a livello mitocondriale. Il target principale delle amine biologicamente attive sembra essere la transizione di permeabilità mitocondriale: spermina, spermidina e putrescina esibiscono un'azione inibitoria mentre l’agmatina (nel fegato) si comporta da induttore o inibitore, a seconda delle concentrazioni usate. Inoltre nei mitocondri è stata dimostrata l’esistenza di due trasportatori specifici: uno per spermina, spermidina e putrescina ed uno per l’agmatina. Lo scopo di questo lavoro è quello di studiare l'azione delle amine biologicamente attive quali regolatrici della permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e del rilascio dei fattori pro-apoptotici in mitocondri isolati da fegato di ratto. In particolare viene analizzata la loro interazione specifica con le strutture di membrana, allo scopo di chiarire il loro meccanismo di azione. La prima parte del lavoro evidenzia il duplice effetto dell’agmatina sul processo di transizione di permeabilità. In particolare l'attenzione è focalizzata sull’effetto inibitorio dell’amina nei confronti dell’apertura del poro di transizione mitocondriale. Infatti, nonostante il suo effetto protettivo sulla transizione di permeabilità, l'amina è in grado di indurre il rilascio di alcuni fattori pro-apoptotici. Una possibile spiegazione considera l'induzione della permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna. Un'ulteriore conferma di questa ipotesi è trattata nella seconda parte della tesi, per mezzo del confronto tra gli effetti mostrati dall’agmatina e dal suo analogo alfa-metil-agmatina, un più potente inibitore della transizione di permeabilità mitocondriale. L’utilizzo di tale analogo permette di escludere che la produzione di perossido di idrogeno osservata in presenza di agmatina sia una delle cause principali della permeabilizzazione della membrana esterna. Nella terza parte, è riportato l'effetto delle poliamine (in particolare della spermina e della spermidina) sulla permeabilizzazione delle membrane mitocondriali e sul rilascio dei fattori pro-apoptotici. Nonostante la ben nota azione protettiva di questi composti nei confronti dell'apertura del poro, spermina e spermidina condividono con l’agmatina un comportamento simile nell'indurre il rilascio di alcuni fattori pro-apoptotici, sebbene attraverso meccanismi diversi. Il loro meccanismo d'azione è perciò indagato, cercando di mettere in evidenza le specifiche componenti di membrana coinvolte. Infine, nella quarta parte, viene mostrato uno studio sul meccanismo di efflusso della spermina, indagandone il possibile collegamento con l'efflusso di ATP e fosfato, molto probabilmente in modo elettricamente neutro. Questa osservazione è supportata dall'uso di inibitori specifici della traslocasi degli adenin nucleotidi e del fosfato. In conclusione, i risultati ottenuti in questo studio innanzitutto sostengono l'ipotesi che la permeabilizzazione delle membrane interna ed esterna possa essere vista come due distinti processi, anche se spesso legati tra loro. Inoltre è possibile affermare che la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna potrebbe essere un punto di contatto tra apoptosi intrinseca ed estrinseca, essendo indotta sia da segnali intra- che extra-mitocondriali. E’ da considerare che il rilascio di citocromo c dai mitocondri non porta in ogni caso all'induzione dell'apoptosi. In particolare lo stato redox della proteina è cruciale per la successiva cascata di eventi: solo il citocromo c ossidato, infatti, è in grado di innescare l'apoptosi. Per questo motivo, è ragionevole pensare che il rilascio di citocromo c indotto dalle amine biologicamente attive possa rappresentare un punto di partenza, ma non un punto di non ritorno. In questo contesto, le poliamine rappresentano uno strumento utile per studiare sia la permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale che la transizione di permeabilità mitocondriale, cercando di delinearne le caratteristiche strutturali e funzionali. Inoltre, a livello cellulare, le poliamine sono in grado di prevenire o indurre l’apoptosi e quest'ultimo effetto è causato dal loro metabolizzazione da parte delle amine ossidasi, con la produzione di composti citotossici. Questa azione dicotomica dipende dalla concentrazione delle poliamine, che è modulata, come dimostrato dai nostri dati, anche attraverso il loro ciclaggio all’interno dei mitocondri. Nonostante siano chiaramente necessari ulteriori studi per individuare tutti i meccanismi strutturali coinvolti nel loro ciclaggio, almeno per la spermina, viene individuata una possibile via di efflusso.