Biocompatible modular nanovectors for anticancer drug delivery and controlled release

Il presente progetto di ricerca si è focalizzato sulla progettazione e lo sviluppo di un nanosistema innovativo ed intelligente per il rilascio direzionato e controllato di farmaci antitumorali. In quest’ottica, i nanosistemi “smart” per il direzionamento di farmaci possono rivestire un ruolo fondamentale grazie al loro accumulo sito-specifico ed il rilascio controllato di molecole attive, offrendo così la possibilità di ridurre gli effetti collaterali causati da una biodistribuzione incontrollata del farmaco e di migliorare la qualità di vita del paziente. Tra i vari sistemi colloidali disponibili in campo farmaceutico, le micelle polimeriche formate da copolimeri anfifilici poliaminoacidici offrono peculiari vantaggi come un aumento della solubilità di farmaci lipofili in acqua, una maggiore biodisponibilità, un'elevata biocompatibilità e versatilità. A tale scopo è stata progettata una libreria di copolimeri anfifilici per il delivery intracellulare di Doxorubicina (Doxo) in grado di auto-assemblarsi in sistemi colloidali. Il backbone polimerico è composto da un blocco idrofilico di polietilenglicole (PEG) e un blocco poliaminoacidico costituito dal derivato γ-idrazinico dell’acido-glutammico (hydGlu) e da Leucina in diversi rapporti molari. In particolare, hydGlu è stato selezionato per la coniugazione di Doxo attraverso la formazione di un legame idrazonico pH-sensibile, che permette un rilascio specifico del farmaco nei compartimenti acidi intracellulari. L’aminoacido Leucina è stato utilizzato non solo come spacer tra i monomeri di acido glutammico per minimizzare l'ingombro sterico del farmaco, ma anche per promuovere l'autoassemblaggio del polimero grazie al suo carattere idrofobico. Il farmaco Doxo è stato scelto per un duplice scopo: in primo luogo, per la sua ben nota attività antitumorale e, in secondo luogo, per promuovere il self-assembling del nanosistema. La libreria di copolimeri anfifilici è stata sintetizzata attraverso la metodica di polimerizzazione “Ring Opening Polymerization” (ROP) usando un polietilenglicole funzionalizzato con un gruppo amminico terminale reattivo (mPEG5kDa-NH2) come macroiniziatore e amminoacidi in forma N- carbossi anidridica (NCA) come monomeri. Inizialmente, mPEG5kDa-OH è stato convertito in mPEG5kDa-NH2 attraverso l’addizione radicalica di cisteamina. Gli analoghi NCA degli aminoacidi γ-benzil-glutammico e Leucina sono stati sintetizzati mediante reazione con trifosgene. Successivamente, mPEG5kDa-NH2 è stato utilizzato come macroiniziatore per la reazione di polimerizzazione dei monomeri NCA, portando alla sintesi di quattro polimeri mPEG5kDa-b- (γ-benzil-Glun-r-Leum) con rapporti molari di acido γ-benzil-glutammico:Leucina di 16: 0, 8: 8, 6:10, 4:12. Successivamente, il gruppo protettore γ-benzil estereo dell'acido glutammico è stato rimosso per reazione diretta con idrazina idrata, portando alla formazione del derivato γ-idrazidico dell’acido glutammico con una resa di conversione del 99%. Pertanto, l'intera libreria di copolimeri è stata convertita nei derivati γ-idrazidici mPEG5kDa-b- (γ-hyd-Glun-r-Leum). Infine, Doxo è stata coniugata al backbone polimerico attraverso la formazione del legame idrazonico pH-sensibile, ottenendo una elevata resa di coniugazione del farmaco per i copolimeri funzionalizzati con Leucina nel blocco poliaminoacidico. I sistemi colloidali ottenuti mediante dialisi sono stati caratterizzati attraverso DLS; TEM, Potenziale Zeta, e determinazione della concentrazione micellare critica (CMC). Le analisi hanno dimostrato che i polimeri coniugati con Doxo assemblano assumendo una forma sferica con dimensione di circa 20 nm, caratteristiche ottimali per l'accumulo selettivo nel tessuto tumorale sfruttando l'effetto EPR, ed evidenziando l'importante ruolo di Doxo e Leucina nel promuovere la formazione del core idrofobico. La bassa concentrazione di CMC ottenuta per i sistemi colloidali può essere indice di una notevole stabilità del sistema e impedire la loro dissociazione nel circolo sanguigno. La coniugazione di Doxo ha apportato un aumento di idrofobicità del blocco poliaminoacidico determinando una maggiore coesione delle micelle e una riduzione della concentrazione di polimero richiesta per il self-assembling. I sistemi colloidali hanno rilasciato selettivamente il farmaco in ambiente acido, mostrando un l’idrosili del legame idrazonico più rapida a pH 5.5 rispetto alle condizioni fisiologiche. Questo si traduce in un rilascio controllato e selettivo di Doxo in compartimenti intracellulari acidi, evitando la dissociazione farmacologica nel sangue. La citotossicità delle formulazioni colloidali è stata testata sulle linee cellulari tumorali murine CT26 e 4T1, rispettivamente carcinoma del colon-retto e carcinoma mammario. Le formulazioni colloidali hanno riportato una citotossicità dose-dipendente su entrambe le linee cellulari, con valori di IC50 paragonabili a quelli ottenuti mediante incubazione con il solo farmaco di riferimento. Inoltre, sono state eseguite analisi di microscopia confocale sulla linea cellulare CT26 per valutare il destino intracellulare del sistema micellare, confermando l’accumulo lisosomiale e il rilascio selettivo intracellulare di Doxo. Sulla base di queste evidenze, l'efficacia antitumorale del sistema è stata valutata in vivo su modelli animali di tumore sottocutaneo. Gli studi sono stati condotti valutando sia la via di somministrazione intratumorale che quella endovenosa. La formulazione contenente il farmaco caratterizzata dal rapporto molare Glutammato:Leucina di 6:10 è stata selezionata per questo scopo poiché si è rivelata la più performante in termini di rilascio di farmaco ed attività citotossica. Gli studi in vivo hanno confermato l’efficienza del sistema micellare in termini di riduzione del volume della massa tumorale, un prolungamento della sopravvivenza degli animali trattati e una tossicità trascurabile sia conseguente a trattamento locale che sistemico.