Gold-based anticancer derivatives of oligopeptides: synthesis, characterization, delivery strategies and biological activity

Il cisplatino (cis-diamminodicloroplatino(II)) è tuttora uno dei farmaci antitumorali più utilizzati, impiegato in particolare per il trattamento del tumore al testicolo e, in combinazione con altri chemoterapici, per la cura del cancro all'ovaio, al polmone a cellule piccole, alla vescica, al cervello e alla mammella. Nonstante la sua efficacia, il suo utilizzo viene fortemente limitato dall'insorgenza nei pazienti di effetti collaterali molto gravi, come l'elevata tossicità verso i tessuti sani (in particulare nefrotossicità) oltre che da meccanismi di resistenza al trattamento o acquisiti dopo alcuni cicli di terapia. Per superare questi inconvenienti, sono stati sintetizzzati e testati come potenziali farmaci antitumorali nuovi complessi sia a base di platino che di altri metalli di transizione. In particolare, alcuni composti di oro, già utilizzati da molti anni per la cura dell'artrite reumatoide (grazie alle loro proprietà anti-infiammatorie e immunosuppressive) sono stati testati per le loro proprietà antiproliferative, aprendo la strada a una nuova classe di potenziali composti antitumorali. Da circa un decennio nel nostro gruppo di ricerca sono stati sintetizzati, caratterizzati e testati nuovi complessi ditiocarbammici di oro(III), che hanno dimostrato promettenti proprietà antiproliferative su diverse linee cellulari tumorali umane. I promettenti risultati ottenuti sia in vitro che in vivo per alcuni composti di “prima generazione” del tipo [AuIIIX2(dtc-L)] (X= Cl, Br; dtc=ditiocarbammato; L= dimetilammina, pirrolidina, esteri della N-metilglicina (Sar)), hanno portato al design di una nuova serie di complessi di "seconda generazione", al fine di aumentarne la biodisponibilità, la selettività e l'uptake cellulare. A questo scopo, sono stati preparati complessi ditiocarbammici funzionalizzati con diversi oligopeptidi, aventi formula generale [AuIIIX2(dtc-Sar/Aib-(AA)n)] (AA = diversi amminoacidi), affinchè potessero essere riconosciuti e trasportati da specifici trasportatori di membrana denominati PEPT (PEPT1 and PEPT2). Queste proteine risultano prevalentemente espresse nelle cellule epiteliali dell'intestino tenue, nella mammella, nel polmone, nel plesso coroideo e nei reni, e vengono in particolare sovraespresse in alcuni tipi di cellule tumorali. La principale caratteristica di queste biomolecole è la loro capacità di trasportare la maggior parte dei di- e tri-peptidi naturali, indipendentemente dalla loro sequenza, dimostrandosi quindi degli eccellenti target per il riconoscimento ed il trasporto selettivo di composti peptido-mimetici farmacologicamente attivi, quali ad esempio antibiotici ß-lattamici ed alcuni inibitori di enzimi convertitori dell'angiotensina (ACE). I complessi sintetizzati hanno mostrato ottime proprietà antiproliferative, esercitando un meccanismo d'inibizione della crescita tumorale diverso da quello normalmente descritto per i farmaci a base di platino comunemente utilizzati in chemoterapia clinica, superandone anche i tipici effetti collaterali e i problemi di resistenza crociata al trattamento. In questo lavoro di tesi sono stati sintetizzati nuovi complessi di Au(III) con leganti peptidoditiocarbammici, i quali sono stati ampiamente caratterizzati attraverso analisi elementare e di diffrazione a raggi-X su monocristallo, NMR mono- e bidimensionale, FT-IR e spettroscopia Uv-Vis. I complessi non-idrosolubili (previa dissoluzione nella minima quantità di DMSO) si sono dimostrati molto reattivi in soluzioni acquose caratterizzate da diverse condizioni di pH o di composizione salina. Generalmente essi tendono ad idrolizzare, scambiando con l'acqua un legante bromuro e portando alla formazione del di-idrosso derivato, insolubile in acqua. Andando però ad analizzare ambienti più complessi, come ad esempio il mezzo di coltura cellulare, è stato notato un effetto stabilizzante derivante probabilmente dalla presenza di particolari componenti del mezzo stesso (e.g. proteine, molecole organiche), come confermato anche da studi di interazione con la proteina del siero BSA (Bovine Serum Albumin). L'attività antiproliferativa dei complessi è stata testata su diverse linee cellulari di tumori umani, rappresentative di diversi tipi tumorali (e.g. polmone, ovaio, mammella), mostrando promettenti attività citotossiche. La loro attività antitumorale è stata ulteriormente confermata in vivo sul tumore xenografico umano alla mammella MDA-MB-231, mentre una valutazione preliminare del profilo tossicologico effettuata ex vivo ha messo in luce un'analogia con i risultati ottenuti per uno degli analoghi composti di "prima generazione". Per superare il problema della scarsa solubilità in soluzioni acquose, oltre che per evitare la tossicità intrinseca del DMSO (normalmente utilizzato per sciogliere i complessi), sono stati valutati nuovi metodi di dispersione. In particolare, sono state preparate, caratterizzate e testate in vitro sia micelle a base di Pluronico F127 che liposomi costituiti da fosfolipidi DPPC. Questi sistemi si sono dimostrati in grado di solubilizzare e stabilizzare i complesi in condizioni fisiologiche, senza tuttavia alterarne le proprietà antiproliferative. Inoltre, micelle funzionalizzate con l'octapeptide CCK8 sono state testate come nanosistemi per il trasporto selettivo verso le cellule tumorali che sovraesprimono il recettore specifico CCK-R. In questo caso i valori di GI50 registrati sono risultati di un ordine di grandezza inferiori rispetto allo stesso sistema non funzionalizzato. Per ottenere maggiori informazioni sul meccanismo d'azione dei complessi, ne è stata in seguito valuatata la capacità di inibire in vitro alcuni enzimi selezionati per la loro rilevanza nell'attivazione della risposta apoptotica nelle cellule tumorali. I composti si sono dimostrati in grado di inbire tutte e tre le funzioni del proteasoma, inibiendo contemporaneamente anche l'attività dell'enzima PARP-1. Studi più dettagliati hanno in seguito riguardato la cinetica di uptake dei complessi di oro da parte delle cellule tumorali, e la valutazione in tempo reale del profilo dell'inibizione della crescita cellulare. I risultati ottenuti hanno suggerito che i complessi esplicano la loro attività citotossica nelle prime 4-5 h dalla somministrazione, agendo probabilmente a livello della membrana cellulare. Questi risultati sottolineano le promettenti proprietà dei composti come potenziali agenti antitumorali, e gettano le basi per il proseguimento della loro caratterizzazione preclinica, la quale prevede una più approfondita valutazione delle loro proprietà farmacologiche e della loro attività biologica.