Le applicazioni biotecnologiche nella medicina traslazionale

Questo lavoro si prefigge di evidenziare il massivo potenziale dell’impiego delle biotecnologie nella medicina traslazionale. La tesi è tripartita sulla base delle tre distinte ricerche in essa illustrate: ciascuna di esse è caratterizzata dall’utilizzo di approcci biotecnologici differenti. La prima ricerca ha come scopo il confronto in vitro del potenziale osteogenico di cellule staminali mesenchimali prelevate da midollo osseo (hBMSCs) e da tessuto adiposo (hASCs). Ancora, la ricerca si prefigge di valutare in vitro la capacità di due DBM (TBM e DBX) di stimolare il differenziamento in senso osteogenico di due popolazioni di cellule staminali (hBMSCs e hASCs). Le cellule mesenchimali staminali prelevate dal tessuto adiposo (Liposuzione Addominale) e dal midollo osseo (Artroprotesi D’anca), sono state coltivate in un Scaffold a base di osso bovino (Orthoss), in presenza di terreno non differenziativo con l’aggiunta di TBM e DBX. In tal modo, sono stati ottenuti 4 diversi gruppi cellulari. Dopo 28 giorni di incubazione, sono stati effettuati i test MTT (vitalità cellulare) e RT-PCR per la variazione dell’espressione genica di Osteopontina, Osteocalcina, Osteonectina e Collagena I. I test MTT hanno dimostrato una maggiore vitalità cellulare delle cellule coltivate con il TBM rispetto alle cellule coltivate con il DBX e nessuna differenza significativa tra i due tipi di cellule mesenchimali. I risultati suddetti sono stati confermati anche con la RT-PCR, in cui si nota un aumento dell’espressione genica dei geni dell’ Osteopontina, Osteocalcina, Osteonectina e Collagene I in quelle cellule coltivate con il TBM rispetto alle cellule coltivate con il DBX e nessuna differenza significativa tra i due tipi di cellule mesenchimali. Alla luce di ciò, è possibile asserire che i risultati hanno dimostrato l’assenza di una differenza significativa nel potenziale osteogenico delle cellule mesenchimali prelevate dal tessuto adiposo e midollo osseo; si è, inoltre, evidenziate che tra le due DBM analizzate il TBM risulta essere migliore rispetto al DBX sia come capacità differenziativa che come sopravvivenza cellulare. La seconda ricerca si basa sullo studio delle applicazione del laser a diodi nell’infiammazione e rigenerazione gengivale, utilizzando bassi livelli di potenze ( Low Level Laser Terapy). Lo scopo di questa ricerca è stato quello di creare un protocollo clinico da poter utilizzare in ambito odontoiatrico. Fibroblasti gengivali umani sono stati isolati da tessuto connettivo gengivale umano, piastrati in multiwell e biomateriale HYAFF a base di acido ialuronico e irradiate con il laser a diodi a diverse potenze (1 W- 24 mW) e a diverso minutaggio ( 10 minuti-75sec). A fine giornata, a 24 e a 48 ore sono stati effettuati i test MTT (vitalità cellulare) e RT-PCR per la variazione dell’espressione genica dei geni del Collagene I e della Fibronectina. Dai test MTT risulta che le cellule trattate con il laser - con una potenza che varia tra i 24 mW e 110 mW e un minutaggio che varia dai 75 sec ai 300 sec - esprimono una vitalità cellulare maggiore rispetto ai CTRL. Tali risultati sono stati confermati anche dalla RT-PCR, in cui si nota un aumento dell’espressione genica dei geni del Collagene I e della Fibronectina di quelle cellule irradiate con una potenza che varia tra i 24 mW e i 110 mW e un minutaggio che varia dai 75 sec ai 300 sec. Conseguentemente, è possibile sostenere che un protocollo clinico che potrebbe essere utilizzato in ambito odontoiatrico è una bassa potenza che varia tra i 24 mW e i 110 mW e un minutaggio che varia dai 75 sec ai 300 sec. La terza ricerca si pone l’obiettivo di studiare in vivo l’effetto della Collagenasi del Vibro Alginoliticus sulla patologia fibroproliferativa della mano Dupuytren. La patologia di Dupuytren è caratterizzata dalla formazione di un cordone fibrotico sull’aponevrosi facciale della mano costituito da Collagene I ma, soprattutto, da Collagene III. I cordoni fibrotici sono stati prelevati in sala operatoria (Aponeverctomia Regionale), trasportati in laboratorio, tagliati a pezzi da 5mm, in ciascuno dei quali sono stati iniettati 20 µl di Collagenasi. Alcuni campioni sono stati sottoposti ad azioni meccaniche di compressioni verticali e distensioni longitudinali; successivamente, in essi sono stati iniettati 20 µl di Collagenasi, altri campioni sono stati trattati con l’aggiunta di 20 µl di EDTA, per la presenza di spot di calcificazioni osservati grazie alla colorazione Azan Mallory e confermati dalla IHC per l’osteopontina. Sono state applicate a 3-6-12-24-30 ore le comuni tecniche istologiche (Azan Mallory, IHC Collage I, Collogene III e Osteopontina). E’ stata utilizzata, inoltre, l’analisi semiquantitativa del Collagene III con il Software Imagej. Le analisi istologiche hanno dimostrato una riduzione del Collagene I e III in tutti i campioni trattati con Collagenasi e lo scioglimento dei nuclei di calcificazione in quei campioni trattati con EDTA. L’analisi semiquantitativa del Collagene III ha mostrato una diminuzione progressiva del segnale del Collagene III a intervalli temporali crescenti e un aumento dell’efficacia dell’utilizzo della Collagenasi se i campioni subiscono dei trattamenti meccanici e l’aggiunta di EDTA. Quindi, la Collagenasi del Vibro Alginoliticus potrebbe essere un’opzione alla terapia non chirurgica delle malattie fibroproliferative delle fasce