Natural Polymer X (NPX): A Novel Adjuvant For Protein-based Vaccination Strategies

L'emergente popolarità di vaccini a subunità costituititi da antigeni sintetici e ricombinanti scarsamente immunogenici, ha sottolineato l’importanza della scoperta di nuovi e potenti adiuvanti capaci di modulare, aumentare ed estendere nel tempo la risposta immunitaria contro tali antigeni. Numerose classi di adiuvanti sono attualmente in fase di sviluppo pre-clinico e clinico, ma solo pochi sono ad oggi hanno ottenuto l’autorizzazione per l'uso clinico nell’uomo. La classe dei polimeri naturali sta emergendo come un'alternativa promettente tra le formulazioni di adiuvanti; grazie alla loro composizione chimica, alle proprietà fisiche e al loro potenziale di funzionalizzazione, i polimeri naturali possono essere, infatti, modificati per incrementare la loro adiuvanticità e indurre una risposta immunitaria ottimale, rendendoli dei validi candidati per la sostituzione dei convenzionali adiuvanti attualmente in uso. Il polimero naturale X (NPX) è un polisaccaride lineare biodegradabile, biocompatibile, non tossico e non infiammatorio che può essere facilmente coniugato a tutti i tipi di antigeni proteici. Inoltre, derivati a basso peso molecolare di NPX si comportano come profili molecolari associati al danno (DAMPs), agendo da agonisti dei recettori Toll-like (TLRs). Questo progetto mira ad identificare le potenzialità di NPX come adiuvante efficace e sicuro da applicare a studi di vaccinazione basati su antigeni proteici. A tal fine, l’antigene modello ovalbumina (OVA) è stato legato covalentemente a NPX, generando il bioconiugato NPX-OVA che è stato utilizzato in esperimenti di immunizzazione in vivo su topo. Diverse strategie di vaccinazione, concentrazioni di antigene coniugato e pesi molecolari di NPX sono stati testati, inoltre è stata valutata l'induzione della risposta umorale mediante test ELISA. Nel complesso, i risultati hanno dimostrato come la coniugazione di NPX con l’antigene modello sia in grado di accrescere fortemente l’immunogenicità dell’OVA, esercitando un notevole effetto adiuvante. I dati ottenuti evidenziano infatti la superiorità dell’adiuvante NPX nei confronti dell’allume, dal momento che NPX è in grado di indurre risposte umorali potenti e durature, che, a differenza di quelle indotte dall’allume, sono caratterizzate anche dalla produzione delle sottoclassi anticorpali IgG2a e IgG2b. Inoltre, è stato dimostrato che la coniugazione di NPX all’OVA consente sia la riduzione del numero di dosi di inoculo che la riduzione della quantità di antigene da utilizzare, dal momento che IgG specifiche per OVA sono state rilevate già dopo una singola iniezione di NPX-OVA e anche a seguito ad immunizzazioni effettuate con dosi molto basse di antigene. In questo lavoro, NPX è stato anche confrontato con altri adiuvanti commerciali (Quil-A, Addavax, adiuvante di Freund completo/incompleto (CFA/IFA), Chitosano, LPS, e Montanide), mostrandosi in grado di indurre una produzione di IgG paragonabile o addirittura superiore a quella prodotta dagli altri adiuvanti testati. Solo la risposta umorale indotta dal CFA/IFA è risultata superiore a quella generata da NPX-OVA, il quale però è risultato sempre più efficiente dei due adiuvanti già approvati per l'uso clinico (allume e Addavax). Esperimenti volti ad analizzare la capacità di NPX di indurre una risposta immunitaria cellulare, hanno portato a risultati controversi. È stato dimostrato che la vaccinazione di topi con NPX-OVA è in grado di indurre risposte citotossiche comparabili a quelle scatenate da adiuvanti noti per la loro capacità di produrre un risposta prevalentemente Th1; tuttavia, la marcatura con il pentamero specifico per il peptide di OVA (SIINFEKL) di cellule di milza, linfonodo e sangue prelevati da topi immunizzati con NPX-OVA, non ha evidenziato quantità misurabili di linfociti CD8+ specifici per SIIKFEKL. Rimane perciò da chiarire se NPX sia in grado di indurre anche risposte citotossiche o se la sua adiuvanticità risieda prevalentemente o unicamente nella capacità di generare risposte umorali potenti e di lunga durata. In questo studio è stata messa in evidenza anche un’altra caratteristica estremamente importante di NPX: la sua biocompatibilità al sito di inoculo e, in generale, il suo profilo di sicurezza. Risultati ottenuti da studi di reclutamento di cellule e analisi di citochine nel muscolo di topo in seguito a vaccinazione hanno evidenziato che NPX è estremamente sicuro e ben tollerato quando inoculato per via intramuscolare, suggerendo che esso agisca apparentemente in modo diverso rispetto agli adiuvanti immunologici classici che innescano forti reazioni infiammatorie nel sito di inoculo. Esperimenti di biodistribuzione in vivo, confermati mediante microscopia a fluorescenza, suggeriscono che NPX promuova la rapida migrazione dell'antigene ai linfonodi drenanti, favorendone l‘accumulo, dove è facilitato l'incontro con le cellule presentati l’antigene. In parallelo, esperimenti condotti in vitro hanno confermato che il bioconiugato NPX-OVA può essere digerito dall'enzima NPXase, producendo frammenti di NPX a basso peso molecolare che da letteratura possono agire come agonisti TLR, e indurre la maturazione di cellule dendritiche (DCs). Ciò è stato confermato da esperimenti in vitro che hanno mostrato come la stimolazione con derivati di NPX a basso peso molecolare sia in grado di attivare le DCs derivate da midollo osseo murino. Questi risultati consentono di ipotizzare un potenziale scenario che identifica il meccanismo di azione in cui NPX agisce favorendo il rapido drenaggio e un preferenziale accumulo dell'antigene nel linfonodo. Allo stesso tempo, NPX potrebbe andare incontro a degradazione da parte degli enzimi NPXasi presenti nei tessuti; i frammenti a basso peso molecolare, generati da questa digestione, potrebbero funzionare come DAMPs, attivando le DCs in seguito al legame con i recettori TLR, stimolando così il riconoscimento e presentazione dell'antigene alle cellule effettrici. Nel complesso, questa tesi identifica NPX come candidato ad essere un nuovo e promettente adiuvante agonista dei TLR, in base alle evidenze sulle sue principali caratteristiche di indurre sia una risposta umorale che citotossica e al meccanismo d'azione, dimostrando, infine, l'efficacia e la tollerabilità in modelli preclinici. I dati ottenuti dimostrano che NPX è un adiuvante naturale, potente e sicuro, che potrebbe essere sfruttato per la progettazione di nuove ed efficienti formulazioni di vaccini a base proteica.