Genomic analysis in cutaneous melanoma: a tool for predictive biomarker identification and molecular classification

Progetto 1: identificazione di signatures molecolari associate alla risposta al trattamento con inibitori del MAPK pathway. I melanomi portatori di una mutazione nel codone V600 del gene BRAF rispondono agli inibitori del MAPK pathway, ma l’efficacia a lungo termine di questa terapia è limitata dallo sviluppo di resistenza, talvolta immediata. In questo studio, abbiamo esaminato le alterazioni molecolari caratterizzanti la progressione del melanoma al fine di identificare fattori predittivi di risposta/resistenza ai MAPK-inibitori. Nello specifico, su una serie di campioni pretrattamento di pazienti affetti da melanoma, trattati con MAPK-inibitori, abbiamo valutato numero di copie del gene BRAF e percentuale di allele V600-mutato, delezione e mutazioni di PTEN, alterazioni del promotore di TERT, e ne abbiamo analizzato l’associazione con la risposta dei pazienti alla terapia. Inoltre, abbiamo determinato il copy number variation dell’intero genoma dei nostri campioni per individuare ulteriori aberrazioni non note potenzialmente associate con la risposta alla terapia. Abbiamo identificato un numero aumentato di copie (gain) del gene BRAF, spesso dovuto a polisomia del cromosoma 7, nel 65% dei pazienti; l’allele mutato è stato trovato in una percentuale compresa tra il 35% e il 65% nel 64% dei pazienti, inferiore al 35% nel 14% dei pazienti e superiore al 65% nel 23% dei pazienti. Dall’analisi di sopravvivenza, è risultato che i pazienti con BRAF diploide o una percentuale di allele mutato inferiore al 35% presentano un più alto rischio di progressione rispetto a coloro che presentano gain di BRAF (HR=2.86; 95% CI 1.29-6.35; p=0.01) o tra il 35% e il 65% di allele mutato (HR=4.54,CI 1.33-15.53; p=0.016), rispettivamente. L’analisi di PTEN ha rivelato la presenza di mutazioni nel 27% dei pazienti, localizzate a livello dei domini catalitico e C2 della proteina codificata; inoltre, il 42% dei casi valutati mostrava una delezione completa del gene, il 35% una delezione parziale, mentre nel 23% dei pazienti non è stata individuata alcuna aberrazione di PTEN. Da notare, delezioni di PTEN sono emerse sia nei casi di melanoma resistente alla terapia, che in quelli che avevano risposto a lungo. Il sequenziamento del promotore del gene TERT ha permesso l’identificazione di mutazioni nel 78% dei pazienti. Le mutazioni -124C>T e -146C>T mostravano la stessa frequenza (36%) nella nostra coorte, mentre la -138-139CC>TT è stata individuata solo nel 5% dei casi. Il 51% dei pazienti presentava inoltre lo SNP rs2853669, noto per contrastare l’effetto attivante delle mutazioni sull’espressione di TERT. Stratificando la coorte di pazienti mutati in base alla presenza/assenza del polimorfismo, i pazienti TERT mutati/SNP carriers mostravano un trend verso una migliore PFS (PFS mediana 11.5 mesi, 95% CI 3.12-19.88) rispetto ai TERT mutati/SNP non-carriers (PFS mediana 7 mesi, 95% CI 4.27-9.72). La mutazione -146C>T, inoltre, correlava con PFS più breve (PFS mediana 5.45 mesi, 95% CI 2.80-9.20) rispetto alla -124C>T (PFS mediana 15.2 mesi, 95% CI 5.57-). Dall’analisi del copy number variation (CNV) sull’intero genoma, le regioni chr3p24, chr3p21.2 e chr17p13.1 hanno mostrato pattern di alterazioni diverse in pazienti responsivi vs. non-responsivi alle terapie; risultano pertanto regioni di potenziale interesse per l’individuazione di nuovi geni coinvolti nella resistenza alla terapia. I nostri dati suggeriscono dunque che l’analisi quantitativa del gene BRAF e il sequenziamento del promotore di TERT costituiscono un utile strumento di selezione dei pazienti con maggiore probabilità di rispondere alla terapia con MAPK-inibitori, contrariamente alla valutazione dello status di PTEN. L’analisi genome-wide, invece, indica di approfondire lo studio dei cromosomi 3 e 17. Progetto 2: ricerca di marcatori biomolecolari per la classificazione del melanoma acrale. Il melanoma acrale lentigginoso è un raro sottotipo di melanoma cutaneo con specifiche caratteristiche morfologiche, epidemiologiche e genetiche. Poiché il genoma del melanoma acrale non è ancora stato pienamente caratterizzato, ne abbiamo analizzato il CNV per individuare quei caratteri genomici peculiari che lo differenziano dal melanoma non acrale. La nostra analisi genome-wide ha evidenziato una maggiore frequenza di delezioni della regione 16q24.2-16q24.3, gains meno frequenti nella regione 7q21.2-7q33, una più accentuata frammentazione genomica e numerosi isocromosomi come caratteri che distinguono il melanoma acrale dal non acrale. Abbiamo inoltre identificato amplificazioni focali nei geni TERT, CCND1, MDM2 e MITF, più rare nei non acrali, laddove interessavano altri geni, come BRAF e MITF. Delezioni focali sono state individuate soprattutto nei geni CDKN2A e PTEN in entrambi i sottotipi di melanoma, anche se più frequenti nei non acrali. I nostri dati, in accordo con il classificare il melanoma acrale come tipo distinto di melanoma, hanno consentito di delinearne alcune delle peculiarità genomiche, chiave per elucidarne anche la patogenesi.