A spatio-temporal dissection of the transcriptional activity of glucocorticoids in zebrafish: a new transgenic line as a living biosensor model.

I glucocorticoidi sono ormoni steroidei con un ruolo di fondamentale importanza durante lo sviluppo embrionale e in molti processi fisiologici durante tutta la vita. Svolgono la loro funzione legandosi al loro recettore che in risposta al legame migra nel nucleo, dimerizza e si lega a specifiche sequenze di DNA responsive ai glucocorticoidi (glucocorticoid responsive elements, GREs). In questo modo regolano positivamente o negativamente (nGREs) la trascrizione di geni bersaglio. Il recettore per i glucocorticoidi può inoltre regolare la trascrizione genica in modo indiretto, mediante interazioni proteina-proteina con altri fattori di trascrizione. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sull’analisi trascrizionale dell’attività dei glucocorticoidi nell’organismo modello zebrafish. Durante la prima parte del percorso di dottorato è stata messa a punto e validata una linea transgenica di zebrafish (ia20) responsiva ai glucocorticoidi, nella quale la proteina fluorescente EGFP (Enhanced-GFP) si trova a valle di nove ripetizioni in tandem della sequenza GRE. Mediante l’osservazione della fluorescenza è quindi possibile monitorare in vivo l’attività trascrizionale dei glucocorticoidi. La fluorescenza endogena inizia ad essere apprezzabile a partire dalla somitogenesi ed è inizialmente ubiquitaria, per poi localizzarsi in siti discreti nei primi giorni di sviluppo dove rimane rilevabile anche in età adulta. In risposta al trattamento con diverse concentrazioni del glucocorticoide sintetico desametasone (DEX), il segnale della EGFP aumenta in modo dose-dipendente, mentre l’inattivazione del trascritto per il gr, ottenuta mediante l’iniezione di un morpholino antisenso, provoca una considerevole diminuzione del segnale e la mancata risposta al DEX. La specificità della linea è stata validata trattando gli embrioni con diversi steroidi alla stessa concentrazione: il segnale aumenta solo in risposta ai glucocorticoidi mentre rimane invariato nei trattamenti con mineralocorticoidi, androgeni ed estrogeni. Inoltre, un campionamento ogni 2 ore nell’arco di un periodo di tempo di 28 ore ha dimostrato che la linea transgenica ia20 è sensibile alle variazioni di concentrazione dei glucocorticoidi endogeni dovute al ritmo circadiano. Queste caratteristiche rendono la linea ia20 un efficace biosensore per analizzare l’attività dei glucocorticoidi in vivo dal punto di vista spaziale e temporale. Durante l’ultimo periodo di dottorato, la linea ia20 è stata messa in background mutante grs357. In questi mutanti, l’attività trascrizionale del recettore dei glucocorticoidi legata ad un’interazione diretta con il DNA viene persa a causa di una singola sostituzione amminoacidica a livello del dominio di legame al DNA. Vengono invece mantenute le altre funzioni di controllo della trascrizione del recettore. La linea è stata generata con lo scopo di caratterizzare l’eventuale presenza di cross-reattività da parte dei diversi ormoni steroidei, in quanto i recettori per i glucocorticoidi, mineralocorticoidi, androgeni e progestinici condividono la capacità di legarsi ai siti GRE (definiti per questo motivo anche “Hormone Responsive Elements”, HREs). Nella linea ia20 in background mutante abbiamo osservato una notevole riduzione nella fluorescenza endogena ed una totale perdita di responsività ai glucocorticoidi anche a concentrazioni elevate su embrioni di tre giorni. Questo risultato suggerisce la mancanza di cross-reattività fra i diversi ormoni steroidei nei primi giorni di sviluppo, e questo a causa della mancata espressione di alti livelli dei recettori degli altri ormoni steroidei. Per quanto riguarda gli stadi più avanzati, la diminuzione nella fluorescenza endogena nei mutanti è stata osservata anche a tre settimane e in alcuni tessuti dell’adulto, in un esperimento preliminare che dovrà essere in seguito approfondito. Esperimenti preliminari su pesci adulti suggeriscono inoltre che la fluorescenza osservata nella linea ia20 su fegato ed intestino derivi solo dall’attivazione del recettore dei glucocorticoidi, in quanto nel mutante questi tessuti non presentano alcun segnale di fluorescenza e non rispondono al trattamento con il DEX. Per quanto riguarda le gonadi, e in misura minore il tessuto muscolare, il segnale fluorescente presente negli esemplari mutanti e la mancata risposta al DEX, possono essere spiegati dall’attività trascrizionale determinata dai recettori per gli androgeni e i progestinici.