Detection of KCNJ5 mutations in the APA tissues and cell-free DNA with a novel Taqman-based approach

Backgouund. L’Iperaldosteronismo primario (PA) è la forma endocrina più comune d’ipertensione arteriosa secondaria con una prevalenza stimata di circa il 4% nella popolazione generale e dell’11% nei pazienti che afferiscono ai centri di riferimento per l’ipertensione. Nei pazienti con ipertensione resistente la prevalenza del PA è stimata pari al 50%, mostrando che tale patologia non è così rara come ritenuto in passato. Le due forme principali di PA sono l’adenoma producente aldosterone (APA), caratterizzato da iperproduzione lateralizzata di aldosterone, e l’iperplasia surrenalica bilaterale (BAH). La distinzione tra le due forme è di cruciale importanza poiché la prima richiede terapia chirurgica, mentre la seconda terapia medica. Considerando che la rimozione dell’APA determina la correzione del quadro biochimico-clinico di PA e la cura o il miglioramento dell’ipertensione, il riconoscimento dell’APA è fondamentale per offrire una chance di guarigione dell’ipertensione o di miglioramento del controllo dei valori pressori ai pazienti che ne sono affetti. Il 40% degli APA presenta mutazioni somatiche nel gene KCNJ5 che codifica per il canale del potassio KIR 3.4. Questo canale gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento del potenziale di membrana pompando il K+ al di fuori della cellula, provocando in tal modo un potenziale di membrana negativo. Allorquando il gene KCNJ5 contiene le mutazioni G151R, T158A o L168R il canale KIR 3.4 acquisisce capacità di condurre Na+ all’interno della cellula. Gli effetti della mutazione a livello della cellula sono depolarizzazione cronica, produzione costitutiva di aldosterone e proliferazione cellulare. L’approccio attualmente in uso per identificare tali mutazioni è il sequenziamento, secondo Sanger, del DNA estratto dal tessuto surrenalico rimosso durante surrenectomia nei pazienti con PA e iperproduzione lateralizzata di aldosterone. Il sequenziamento del DNA, tuttavia, è costosa richiede tempo e non è disponibile di routine in tutti i laboratori. Scopo generale dello studio è stato quello di sviluppare una strategia alternativa al sequenziamento che preveda l’uso delle sonde Taq-man in Real Time PCR (Q-PCR) per il rilevamento di mutazioni KCNJ5 nel tessuto surrenalico e nel DNA circolante (cell-free DNA, cf-DNA) isolato da sangue periferico. Lo sviluppo di questa metodologia potrebbe semplificare notevolmente l’identificazione delle mutazioni KCNJ5 negli APA e, infine, permetterne la detenzione nel DNA del sangue circolante. In sintesi, l’approccio metodologico include: sviluppo di una nuova strategia basata sull’utilizzo delle sonde Taq-man per rilevare le mutazioni nel gene KCNJ5. Sviluppo di un protocollo per isolare il cf-DNA da sangue delle vene surrenaliche e dalla vena cava inferiore. Misurazione della concentrazione del cf-DNA valutandone la sua frammentazione. Identificazione di mutazioni nel gene KCNJ5 a partire dal cf-DNA Risultati. Applicando la tecnologia sviluppata nel nostro laboratorio, basata sulle sonde Taq-man, sono stati identificati correttamente 30 pazienti mutati in una coorte di 50 pazienti APA consecutivi, senza errori di classificazione. Dopo aver isolato il cf-DNA dal sangue delle vene surrenaliche e dalla vena cava inferiore, e misurato la sua concentrazione, abbiamo valutato la frammentazione del cf-DNA in 24 campioni con l'indice di integrità. I bassi valori dell’indice d’integrità riscontrati nei cf-DNA isolati da sangue venoso surrenalico suggeriscono che la ghiandola surrenalica rilasci per apoptosi frammenti di DNA. L’analisi HRM dei cf-DNA isolati dal sangue delle vene surrenaliche di un paziente con un APA sinistro contenente la mutazione L168R ha permesso d’identificare correttamente la mutazione nel cf-DNA isolato dalla vena surrenalica sinistra. Conclusioni e prospettive. La tecnologia basata sulle sonde Taq-man ha permesso d’identificare, senza errori di misclassificazione, in una coorte di 50 pazienti con APA, tutti i 30 pazienti che presentano una mutazione del gene KCNJ5. Tale strategia, pertanto, potrebbe rappresentare un’alternativa alla ben più lunga e complessa tecnica basata sul sequenziamento del DNA. I risultati del nostro studio hanno anche mostrato che è possibile isolare il cf-DNA da esigue quantità di sangue raccolto dalle vene surrenaliche permettendo l’identificazione delle mutazioni KCNJ5 usando il cf-DNA tramite approccio combinato sonde Taq-man e analisi HRM. Quest’ultimo approccio, che prevede l’uso del cf-DNA richiede, tuttavia, conferma in un ampio numero di soggetti. La stessa strategia potrebbe anche essere impiegata in futuro per la rilevazione di mutazioni germinali KCNJ5 responsabili della nota forma ereditaria d’iperaldosteronismo FH-3.