La possibilità di riprogrammare le cellule adulte in cellule pluripotenti indotte, scoperta nel 2006 da Yamanaka, ha aperto nuove allettanti prospettive sia per lo studio dei processi di differenziamento che portano allo sviluppo di organi e tessuti, sia per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Per poter sfruttare a pieno le potenzialità nel campo della ricerca scientifica e medica delle cellule staminali indotte, è tuttavia necessario sviluppare tecnologie innovative che permettano di ricreare in vitro le caratteristiche riscontrate in vivo. In particolare nell’ultimo decennio è stato scoperto che il microambiente meccanico esercita una notevole influenza sui processi cellulari, regolando la morfologia, l’espressione genica e il differenziamento delle cellule stesse. Nonostante la meccanotrasduzione, ovvero il processo secondo cui gli stimoli meccanici esterni vengono tradotti dalle cellule in processi biologici, sia presente in tutte le cellule, si ritiene che possa avere particolare rilevanza nei tessuti che in vivo sono sottoposti a maggiori stimoli meccanici. In particolare, si è visto come gli stimoli meccanici esercitino una notevole influenza nello sviluppo e maturazione dei tessuti del sistema cardiovascolare e come stress meccanici anomali possano essere correlati all’insorgenza di patologie cardiovascolari. Il sistema cardiovascolare riveste un particolare interesse nel mondo scientifico e clinico in quanto le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte al mondo, e anche i costi associati alla prevenzione e al trattamento di tali patologie sono particolarmente rilevanti. Per giunta, la cardio-tossicità è la principale causa di rigetto dei nuovi farmaci, rendendo lo studio del sistema cardiocircolatorio estremamente rilevante anche nella fase di sviluppo farmaceutico. Lo scopo di questo lavoro è sviluppare nuove tecnologie atte a riprodurre in vitro il microambiente meccanico presente in vivo, con particolare riferimento al sistema cardiovascolare, per consentire lo studio della risposta cellulare agli stimoli meccanici. Nello specifico, le tecnologie sviluppate potranno essere usate per riprodurre gli stimoli a cui il sistema cardiovascolare è sottoposto durante sforzi intensi, come ad esempio la guida agonistica di motocicli. In particolare è stato posta l’attenzione alla riproduzione della morfologia delle cellule del tessuto cardiaco e delle deformazioni meccaniche tipiche del sistema cardiovascolare. In primo luogo, per riprodurre la polarizzazione tipica delle cellule del muscolo cardiaco, sono state delineate o ottimizzate strategie per ottenere colture allineate di cardiomiociti su vetro. L’allineamento viene ottenuto creando linee di esclusione cellulare costituite da un gel di poliacrilamide, alternate a linee in cui l’adesione cellulare viene favorita mediante trattamento con proteine della matrice extracellulare. Lo sviluppo di un metodo robusto e preciso per la realizzazione di colture di cardiomiociti allineati permetterà lo studio dell’effetto della topologia e polarizzazione sull’espressione genica delle cellule, e inoltre permetterà di analizzare la morfologia delle giunzioni cardiache e la trasmissione degli impulsi elettrici tra cellule adiacenti. Successivamente le tecniche di allineamento sono state trasferite anche ai materiali materiali elastomerici, come il PDMS, per permettere la sollecitazione meccanica di colture allineate, similmente a quanto avviene negli organi. Il primo sistema di stretch meccanico è stato sviluppato per effettuare analisi di estrazione di proteine, RNA o DNA. È costituito da una camera di coltura di 9cm2 e la stimolazione avviene attraverso la trazione meccanica esercitata da ElectroForce® planar biaxial TestBench (Bose), in questo caso l’allineamento cellulare viene imposto tramite la realizzazione sulla superficie di coltura di canali a differente altezza su cui si dispongono le cellule. Il secondo sistema di stretch è stato sviluppato principalmente per effettuare analisi di imaging, come immuofluorescenze, e di patch clamp. La camera di coltura è pari a 1cm2 e la stimolazione meccanica avviene gonfiando una membrana in apposite aree rettangolari di deformazione, che costituiscono circa il 40% della totale area di coltura. In questo caso l’allineamento cellulare viene imposto tramite la realizzazione di righe cellule-repellenti in poliacrilamide, sfruttando lo stesso principio adottato nel caso del vetro. Entrambi i sistemi di coltura sono stati testati per dimostrarne le biocompatibilità e per verificare che gli stimoli meccanici che sviluppati sono tali da innescare una risposta cellulare.
Technologies to study the mechanosensitive response of cardiovascular cell cultures
PREVEDELLO, LIA
2016
Abstract
La possibilità di riprogrammare le cellule adulte in cellule pluripotenti indotte, scoperta nel 2006 da Yamanaka, ha aperto nuove allettanti prospettive sia per lo studio dei processi di differenziamento che portano allo sviluppo di organi e tessuti, sia per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Per poter sfruttare a pieno le potenzialità nel campo della ricerca scientifica e medica delle cellule staminali indotte, è tuttavia necessario sviluppare tecnologie innovative che permettano di ricreare in vitro le caratteristiche riscontrate in vivo. In particolare nell’ultimo decennio è stato scoperto che il microambiente meccanico esercita una notevole influenza sui processi cellulari, regolando la morfologia, l’espressione genica e il differenziamento delle cellule stesse. Nonostante la meccanotrasduzione, ovvero il processo secondo cui gli stimoli meccanici esterni vengono tradotti dalle cellule in processi biologici, sia presente in tutte le cellule, si ritiene che possa avere particolare rilevanza nei tessuti che in vivo sono sottoposti a maggiori stimoli meccanici. In particolare, si è visto come gli stimoli meccanici esercitino una notevole influenza nello sviluppo e maturazione dei tessuti del sistema cardiovascolare e come stress meccanici anomali possano essere correlati all’insorgenza di patologie cardiovascolari. Il sistema cardiovascolare riveste un particolare interesse nel mondo scientifico e clinico in quanto le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte al mondo, e anche i costi associati alla prevenzione e al trattamento di tali patologie sono particolarmente rilevanti. Per giunta, la cardio-tossicità è la principale causa di rigetto dei nuovi farmaci, rendendo lo studio del sistema cardiocircolatorio estremamente rilevante anche nella fase di sviluppo farmaceutico. Lo scopo di questo lavoro è sviluppare nuove tecnologie atte a riprodurre in vitro il microambiente meccanico presente in vivo, con particolare riferimento al sistema cardiovascolare, per consentire lo studio della risposta cellulare agli stimoli meccanici. Nello specifico, le tecnologie sviluppate potranno essere usate per riprodurre gli stimoli a cui il sistema cardiovascolare è sottoposto durante sforzi intensi, come ad esempio la guida agonistica di motocicli. In particolare è stato posta l’attenzione alla riproduzione della morfologia delle cellule del tessuto cardiaco e delle deformazioni meccaniche tipiche del sistema cardiovascolare. In primo luogo, per riprodurre la polarizzazione tipica delle cellule del muscolo cardiaco, sono state delineate o ottimizzate strategie per ottenere colture allineate di cardiomiociti su vetro. L’allineamento viene ottenuto creando linee di esclusione cellulare costituite da un gel di poliacrilamide, alternate a linee in cui l’adesione cellulare viene favorita mediante trattamento con proteine della matrice extracellulare. Lo sviluppo di un metodo robusto e preciso per la realizzazione di colture di cardiomiociti allineati permetterà lo studio dell’effetto della topologia e polarizzazione sull’espressione genica delle cellule, e inoltre permetterà di analizzare la morfologia delle giunzioni cardiache e la trasmissione degli impulsi elettrici tra cellule adiacenti. Successivamente le tecniche di allineamento sono state trasferite anche ai materiali materiali elastomerici, come il PDMS, per permettere la sollecitazione meccanica di colture allineate, similmente a quanto avviene negli organi. Il primo sistema di stretch meccanico è stato sviluppato per effettuare analisi di estrazione di proteine, RNA o DNA. È costituito da una camera di coltura di 9cm2 e la stimolazione avviene attraverso la trazione meccanica esercitata da ElectroForce® planar biaxial TestBench (Bose), in questo caso l’allineamento cellulare viene imposto tramite la realizzazione sulla superficie di coltura di canali a differente altezza su cui si dispongono le cellule. Il secondo sistema di stretch è stato sviluppato principalmente per effettuare analisi di imaging, come immuofluorescenze, e di patch clamp. La camera di coltura è pari a 1cm2 e la stimolazione meccanica avviene gonfiando una membrana in apposite aree rettangolari di deformazione, che costituiscono circa il 40% della totale area di coltura. In questo caso l’allineamento cellulare viene imposto tramite la realizzazione di righe cellule-repellenti in poliacrilamide, sfruttando lo stesso principio adottato nel caso del vetro. Entrambi i sistemi di coltura sono stati testati per dimostrarne le biocompatibilità e per verificare che gli stimoli meccanici che sviluppati sono tali da innescare una risposta cellulare.File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14242/81284
URN:NBN:IT:UNIPD-81284