Low-molecular-weight thiols: identification of novel thiol compounds and applications in winemaking processes

I tioli sono composti ridotti dello zolfo che svolgono importanti funzioni in animali e piante. Il gruppo -SH è fortemente nucleofilo, per tale motivo queste molecole sono spesso coinvolte in processi biologici di ossidoriduzione, come ad esempio la modulazione degli stress ossidativi e la partecipazione a varie reazioni enzimatiche. I tioli a basso peso molecolare (LMW) sono una classe di composti coinvolti principalmente nel mantenimento dell’omeostasi ossidoriduttiva nella cellula, tale caratteristica si deve alla reattività dei loro gruppi tiolici nucleofili. Nelle piante sono coinvolti nella risposta a quasi tutti i fattori di stress e nella regolazione del metabolismo cellulare. I tioli LMW possono legarsi o creare complessi con composti tossici disattivandoli (detossificazione), inoltre possono modificare, dopo la traduzione, enzimi regolatori. Queste molecole sono implicate nella qualità e salubrità degli alimenti e anche nella salute umana. I tioli LMW più studiati sono il glutatione e i suoi composti derivati (cisteina, gamma-glutamil-cisteina e cisteinil-glicina). In letteratura sonostati descritti altri tioli LMW come la cisteammina, l’omocisteina e molti altri tioli volatili specie-specifici di cui però poco è conosciuto. In particolare, nelle piante è dimostrata la presenza di moltissimi tioli specie-specifici e organo-specifici molti dei quali però non sono ancora stati identificati. Alcuni di questi tioli LMW sconosciuti sono luce-dipendenti e ciò suggerisce un loro coinvolgimento nel processo della fotosintesi. I miglioramenti nella tecnologia potrebbero aiutare lo studio e la conoscenza della funzione fisiologica e metabolica di questi composti. Tuttavia la loro identificazione è resa ardua dalla loro bassa concentrazione nei tessuti vegetali. In questo lavoro, allo scopo di scoprire nuovi tioli non ancora identificati, sono stati derivatizati con SBD-F degli estratti di piante e in seguito i derivatizzati sono stati sottoposti ad analisi HPLC a fluorescenza e LC-MS/MS in modalità negativa usando una trappola ionica (Varian 500 MS) per ottenere la frammentazione. Sono stati usati come riferimento i tioli LMW già noti come la cisteina, l’omocisteina, il glutatione, la cisteammina, la gamma-glutamil-cisteina, l’N-acetilcisteina e la cisteinil-glicina, i cui modelli di frammentazione sono stati inizialmente studiati per evidenziare la modalità di frammentazione e i marcatori molecolari che hanno consentito la identificazione sistematica di tioli LMW sconosciuti. Inoltre è stata ottenuta la misurazione ad alta risoluzione su spettrometro di massa Q-ToF (Waters) su Xevo G-2. Dopo la derivatizzazione con fluoroforo i tioli possono essere facilmente riconosciuti dallo spettro di frammentazione per la presenza di un chiaro segnale dato dal frammento SBD-S (m/z 231). Questo frammento corrisponde al fluoroforo legato al gruppo tiolico, ed è stato usato per marcare e confermare la presenza del gruppo tiolico nelle molecole sconosciute. In questo modo le molecole possono essere identificatee poi confermate dall’analisi Q-ToF come nel caso del tioglucosio e di derivati contenenti glutatione. Il protocollo che è stato definito con il presente lavoro permette ora l’identificazione di nuovi composti dello zolfo al momento sconosciuti. Nel processo di produzione del vino, i tioli LMW e il glutatione in particolare, hanno una importante funzione antiossidante che si manifesta nell’uva, nel mosto e nel vino. I tioli contribuiscono a contrastare l’imbrunimento ossidativo delle proteine nell’uva e soprattutto nel mosto durante la fermentazione e del vino nei diversi processi di lavorazione. I tioli giocano perciò un ruolo chiave nella conservazione del vino con la loro attività antiossidante, in particolar modo nei vini bianchi. Per questa ragione è stato condotto uno studio volto a sviluppare una metodologia semplice e rapida per la quantificazione dei tioli LWM totali. In tale studio sono state poste a confronto diverse varietà tedesche di uva da vino. I composti dello zolfo sono stati estratti ed analizzati utilizzando un colorante fluorescente SBD-F e separazione HPLC-FL. Sono stati quantificati anche gli zuccheri e gli acidi organici tramite HPLC. I risultati di questa quantificazione mostrano un’elevata riproducibilità tra i campioni e tra le misurazioni di questi composti nelle bacche. Il metodo è utilizzabile anche su mosto, vino e lieviti. Il metodo permette non solo la quantificazione del glutatione ma anche di altri composti relativi nello stesso cromatogramma e mostra una correlazione tra di essi. Il confronto di varietà differenti mostra la presenza di GSH nella maggior parte dei tioli dell’uva, mentre il loro contenuto è molto influenzato dalla varietà. In considerazione del loro ruolo di antiossidanti, il GSH e i tioli LMW possono avere un ruolo favorevole nella vinificazione e sono perciò un fattore fondamentale che deve essere preso in considerazione nelle decisioni che riguardano il processo di produzione del vino.