THE COMBINED USE OF TRANSCRANIAL MAGNETIC STIMULATION AND ELECTROENCEPHALOGRAPHY IN THE INVESTIGATION OF REACTIVITY, CONNECTIVITY AND PLASTICITY OF THE PRIMARY MOTOR CORTEX

La presente tesi si compone di due parti principali: una teorica e una sperimentale. La prima parte, suddivisa in due capitoli, è un approfondimento teorico sullo strumento stimolazione magnetica transcranica (TMS) e sul suo utilizzo simultaneo (ossia, in coregistrazione) con le tecniche di neuroimaging. La seconda parte comprende alcuni degli studi condotti durante il mio dottorato. Nello specifico, si tratta di tre studi che coprono i diversi aspetti applicativi delle ricerche che ho condotto in questi tre anni, ossia lo studio e l’utilizzo della coregistrazione TMS-EEG in ricerca (studio 1), in ambito clinico (studio 2) e per aspetti tecnico-metodologici (studio 3). Il primo studio (studio 1), condotto nel Dipartimento di Psicologia Generale di Padova, era volto all’analisi degli effetti neuromodulatori di un protocollo rTMS su volontari sani. Il secondo studio (study 2) è stato condotto all’Istituto di Neurologia dello University College London (Londra, Regno Unito) all’interno del progetto internazionale “TrackOnHD”, uno studio longitudinale avente come obiettivo l'indagine approfondita della Malattia di Huntington (HD) attraverso un approccio multimodale. L’obiettivo di questo studio era la ricerca di potenziali marker TMS-EEG che riflettessero il deficit di inibizione cerebrale che caratterizza questa patologia. Il terzo studio (study 3), svolto in collaborazione col Dipartimento di Ingegneria dell’Informazione di Padova, aveva l’obiettivo di sviluppare un algoritmo di correzione in grado di rimuovere un artefatto indotto dalla TMS durante la registrazione EEG. CAPITOLO I - LA STIMOLAZIONE MAGNETICA TRANSCRANICA (TMS) Negli ultimi anni lo sviluppo di nuove tecniche in grado di analizzare l’attivazione cerebrale durante processi cognitivi e motori, ha portato ad un avanzamento progressivo delle conoscenze sul cervello umano. La stimolazione magnetica transcranica (TMS) è stata uno degli strumenti la cui popolarità è cresciuta in questi ultimi anni, grazie alla possibilità di stimolare, in modo focale e non invasivo, il cervello in vivo (Barker et al., 1985). Tale capacità ha consentito, per la prima volta, la straordinaria possibilità di inferire delle relazioni causali tra cervello, processi cognitivi e motori, e comportamento (Pascual-Leone et al., 2000). Nel primo capitolo della presente tesi vengono passate in rassegna tutte le possibili applicazioni della TMS in campo cognitivo, fisiologico e riabilitativo. Nello specifico, la prima parte è dedicata ai meccanismi di funzionamento della TMS e ai parametri di stimolazione che ne definiscono i diversi effetti sul cervello. Nella seconda parte vengono invece passati in rassegna i tre principali protocolli di stimolazione: la TMS a singolo impulso, utilizzata per la caratterizzazione spaziale e temporale dei processi cognitivi, per analizzare la reattività della corteccia motoria primaria, e per verificare l’integrità del tratto cortico-spinale; la TMS a doppio impulso, per studiare la connettività e l’interazione di network cerebrali a riposo e durante lo svolgimento di un task; e la TMS ripetitiva (rTMS), utilizzata per analizzare i fenomeni di plasticità cerebrale sia durante processi cognitivi, sia in relazione a trattamenti riabilitativi. CAPITOLO II - L’UTILIZZO SIMULTANEO DELLA TMS CON L’EEG ED ALTRE TECNICHE DI NEUROIMAGING Nonostante la grande popolarità che la TMS ha conosciuto negli ultimi anni, molti aspetti del suo meccanismo d’azione sono ancora poco chiari (Miniussi et al., 2010). Tale ambiguità è dovuta al fatto che, fatta eccezione per la corteccia motoria e visiva primaria, la stimolazione TMS non fornisce dei marker “visibili” di eccitabilità corticale. Negli ultimi anni, grazie al miglioramento tecnologico degli strumenti di indagine neuroscientifica, si è iniziato a utilizzare simultaneamente (in coregistrazione) la TMS con diverse tecniche di neuroimaging. Ciò ha consentito di trarre delle inferenze di tipo “causale” e non più solo “correlazionale” (come nei tradizionali studi di neuroimaging) grazie alle informazioni spaziali e temporali sull’effetto della TMS che le tecniche di neuroimaging offrono. Nel secondo capitolo della presente tesi, vengono trattati dettagliatamente le potenzialità e i limiti delle diverse coregistrazioni TMS-neuroimaging. In particolare, nella parte centrale del capitolo è dato ampio spazio all’argomento centrale di questa tesi, ossia la coregistrazione TMS-EEG. L’approccio TMS-EEG, tra i vari metodi di coregistrazione, è stato quelli che negli ultimi anni ha riscontrato maggiore successo e diffusione, dovuto all’enorme potenzialità che questo metodo garantisce nello studio delle dinamiche cerebrali. L’EEG, infatti, è in grado di registrare, ad altissima risoluzione temporale, i potenziali post-sinaptici indotti dalla depolarizzazione neuronale evocata dalla TMS (Ilmoniemi et al., 1997). L’analisi dell’attività EEG indotta dalla TMS - in termini di tempo, spazio, frequenza e potenza - è in grado di fornire delle preziose informazioni sia sull’attivazione locale indotta dalla stimolazione (reattività cerebrale), sia su quella distale (connettività cerebrale), sia sulle modificazioni a seguito di protocolli di stimolazione ripetitiva (plasticità cerebrale). D’altra parte, la coregistrazione TMS-EEG presenta numerose difficoltà di tipo tecnico, dovuto ai numerosi artefatti che la stimolazione elettromagnetica induce sul segnale EEG (così come sui segnali delle altre tecniche di neuroimaging), questi aspetti sono trattati in maniera dettagliata all’interno del capitolo. Infine, l’ultima parte del capitolo è dedicata agli altri metodi di coregistrazione TMS con risonanza magnetica (MRI), risonanza magnetica funzionale (fMRI), tomografia a emissione di positroni (PET), tomografia a emissione di fotone singolo (SPECT) e spettroscopia del vicino infrarosso (NIRS). CAPITOLO III – STUDIO 1: EFFETTI NEUROMODULATORI DELLA RTMS A BASSA FREQUENZA: EVIDENZE DALL’APPROCCIO TMS-EEG Tradizionalmente gli effetti neuromodulatori della rTMS sono stati studiati attraverso l’analisi dei potenziali motori evocati (MEP). Tuttavia, come noto, i MEP sono una misura indiretta dell’eccitabilità corticale avendo una forte componente anche spinale. Con lo sviluppo di nuovi sistemi EEG compatibili con la TMS, è stato possibile analizzare gli effetti della stimolazione in modo più diretto, tramite l’analisi dei potenziali corticali evocati dalla TMS (TEPs). In questo studio abbiamo analizzato l’effetto di un protocollo di TMS ripetitiva (rTMS) a bassa frequenza (1 Hz) molto noto, soprattutto in ambito riabilitativo, per sortire un effetto di inibizione dell’eccitabilità corticale. Il protocollo è stato applicato sulla corteccia motoria primaria di quindici volontari sani e sulla corteccia visiva primaria di altri quindici volontari sani, assunti come gruppo di controllo per analizzare la specificità spaziale della stimolazione. Gli effetti della stimolazione ripetitiva sono stati testati su diverse misure elettrofisiologiche evocate da una stimolazione a singolo impulso della corteccia motoria, prima e subito dopo il protocollo rTMS, ossia: MEP, TEPs, local mean field power (LMFP) e distribuzione dell’attività sullo scalpo. I risultati sui MEP hanno mostrato una diminuzione significativa dell’ampiezza a seguito del protocollo rTMS sulla corteccia motoria. I risultati sui TEP hanno mostrato un pattern noto composto di quattro principali picchi: P30, N45, P60 e N100. A seguito del protocollo rTMS sulla corteccia motoria si è osservato un incremento significato dell’ampiezza dei TEP P60 e N100, la cui origine è legata all’attività dei potenziali post-sinaptici inibitori GABAb (Ferreri et al., 2011; Premoli et al., 2014). I risultati sul LMFP hanno mostrato un incremento di attività generale indotta dalla TMS sulla corteccia motoria a partire da circa 90 ms dalla stimolazione, ossia la latenza del picco massimo di inibizione GABAb. A seguito del protocollo di stimolazione di controllo, applicato sulla corteccia visiva, non si è riscontrato nessun cambiamento significativo. I risultati di questo studio hanno una rilevanza su tre aspetti: (1) si è confermato l’effetto inibitorio del protocollo rTMS a 1-Hz, offrendo anche un correlato centrale di inibizione (TEPs) oltre che periferico (MEPs); (2) sono state definite la spazialità e l’origine dell’inibizione indotta dalla rTMS a bassa frequenza; (3) la N100 evocata dalla TMS si conferma essere un marker affidabile del grado di inibizione corticale. I risultati di questo studio potrebbero avere una rilevanza sia in campo terapeutico e riabilitativo, specie per i disturbi alla cui base si suppone vi sia un deficit di inibizione corticale (ad es. malattia di Parkinson, malattia di Huntington); sia in campo di ricerca, specie in studi in cui si vogliano correlare performance a task cognitivi o motori con il grado di eccitazione/inibizione corticale. CAPITOLO IV – STUDIO 2: DEFICIT DI INIBIZIONE NELLA MALATTIA DI HUNTIGTON: EVIDENZE DALLA COREGISTRAZIONE TMS-EEG Evidenze recenti hanno mostrato le potenzialità dell’utilizzo della coregistrazione TMS-EEG in ambito clinico e diagnostico. Diverse misure TMS-EEG in termini di potenziali evocati (TEPs), analisi di sorgenti, attività oscillatoria e potenza dell’attività globale, sono state utilizzate per lo studio di dinamiche cerebrali deficitarie in diverse patologie, come: schizofrenia (Ferrarelli et al., 2008); disordini psicotici (Hoppenbrouwers et al., 2008); depressione (Kähkönen et al., 2005); disturbi di coscienza (Massimini et al., 2005); epilessia (Rotenborg et al., 2008) e autismo (Sokhadze et al., 2012). Ad esempio, diverse evidenze hanno mostrato il potenziale contributo dei TEPs nello studio degli equilibri eccitatori/inibitori corticali, data la loro origine GABAergica (Ferreri et al., 2011; Premoli et al., 2014). In particolare, la N100 TMS-evocata sembra essere strettamente correlata al grado di inibizione GABAergica, come mostrato da evidenze a carattere farmacologico (ad es. Kähkönen et al., 2003; Premoli et al., 2014); studi comportamentali (ad es. Bender et al., 2005; Bonnard et al., 2009) e studi in pazienti (ad es. Helfrich et al., 2013). Nel presente studio, facente parte di un ampio progetto internazionale multicentrico (“TrackOnHD”), abbiamo utilizzato la coregistrazione TMS-EEG per analizzare dei possibili marker elettrofisiologici della malattia di Huntington, tramite stimolazione della corteccia motoria primaria. La malattia di Huntington (HD) è caratterizzata da una progressiva degenerazione dei neuroni striatali di natura GABAergica. Tale degenerazione porta a un eccessivo incremento del tono eccitatorio mediato dal glutammato, un fenomeno noto come eccitossicità. Nel presente studio sono stati analizzati dodici pazienti HD e dodici volontari sani su varie misure TMS-EEG, EMG, fMRI e cliniche (nel capitolo sono riportati solo i risultati relativi alle misure TMS-EEG). I risultati hanno mostrato una riduzione significativa e specifica della N100, come rilevato dall’analisi dei TEP per permutazioni punto-per-punto e dall’analisi dell’attività media globale da 94 a 104 ms dopo l’impulso TMS. Le mappe dello scalpo della distribuzione dell’attività hanno mostrato una riduzione della negatività su entrambi gli emisferi, con un effetto maggiore sul sito di stimolazione. Le analisi di perturbazione dello spettro evento-relata e della coerenza inter-trial hanno mostrato una differenza significativa nell’attività oscillatoria dei due gruppi all’interno della finestra di interesse GABAb-ergico (60-110 ms dopo l’impulso TMS). I risultati osservati potrebbero essere prodotti dal deficit di inibizione GABAergica nei pazienti HD conseguente alla degenerazione neuronale nello striato. Anche se preliminari, i risultati dello studio hanno rilevato dei marker TMS-EEG potenzialmente d’interesse per la valutazione dei deficit inibitori in pazienti HD. Ulteriori analisi sono necessarie per correlare i risultati ottenuti con le altre misure raccolte all’interno del progetto. CAPITOLO V – STUDIO 3: ARTEFATTI TMS-EEG: UN NUOVO ALGORITMO ADATTATIVO PER IL DETREND DEL SEGNALE Durante un EEG, la stimolazione TMS può generare un artefatto a lunga latenza, noto come artefatto “decay”. Tale artefatto rappresenta un problema per l’analisi dei potenziali evocati dalla TMS (TEP). In letteratura, per risolvere il problema, sono comunemente utilizzate due principali strategie: l’utilizzo di un detrend lineare e l’utilizzo dell’independent component analysis (ICA). Tuttavia, nessuna di queste soluzioni può essere considerata ottimale. Per quanto riguarda l’utilizzo di un detrend lineare, dal momento che nella maggior parte dei casi l’artefatto decay non segue un andamento lineare, questo tipo di correzione risulta inefficiente. Per quanto invece riguarda l’ICA, anche questa procedura presenta dei limiti intrinseci: (1) può essere eccessivamente influenzato dalle scelte dello sperimentatore e (2) può causare la rimozione di componenti fisiologiche, oltre che artefattuali. Il nostro obiettivo è di verificare l’efficienza di un nuovo detrend adattivo, sviluppato su MATLAB, in collaborazione col dipartimento di Ingegneria Informatica di Padova, capace di discriminare i diversi trend dell’artefatto decay (ossia lineare e non-lineare). Quaranta volontari sani sono stati stimolati con 55 impulsi TMS singoli sulla corteccia motoria primaria di sinistra. Le risposte EEG indotte dalla TMS sono state analizzate in cinque condizioni: RAW (in cui non veniva applicata nessuna correzione dell’artefatto decay); INFOMAX29 (in cui l’artefatto decay veniva corretto con un algoritmo ICA-INFOMAX, considerando tutti i 29 canali); FASTICA (in cui l’artefatto decay veniva corretto con un algoritmo fastICA, considerando tutti i 29 canali); INFOMAX15 (in cui l’artefatto decay veniva corretto con un algoritmo ICA-INFOMAX, considerando solo 15 canali) e ALG (in cui l’artefatto decay veniva corretto tramite il nostro algoritmo adattivo). Per verificare se la correzione dell’artefatto avesse influenzato anche i TEP, sono state analizzare le differenze in una finestra temporale da -100 a +400 ms dall’impulso TMS attraverso l’utilizzo di un test per permutazioni, non-parametrico e corretto per cluster. Successivamente, sono state comparate le ampiezze e le latenze picco-picco dei TEP all’interno delle finestre temporali negli elettrodi risultati significativi. La risposta grand-average ha rilevato cinque picchi principali: P30, N45, P60, N100 e P180. Sono state rilevate delle differenze significative (i.e. Monte Carlo p < 0.05) in un cluster di elettrodi vicino alla stimolazione, comprendente i canali FC1, CP1, C3 e FC2. Le analisi sull’ampiezza picco-picco hanno rilevato una significativa modulazione dell’ampiezza dopo la correzione INFOMAX29 (in 3 TEP su 8), FASTICA (in 4 TEP su 12), INFOMAX15 (in 5 TEP su 15) e ALG (in 2 TEP su 15), rispetto al segnale RAW originale. I risultati LMFP e delle mappe di distribuzione sullo scalpo hanno rilevato diverse anomalie a seguito della correzione INFOMAX29 e FASTICA. I risultati hanno mostrato che la correzione ICA modifica in modo significativo l’ampiezza, la morfologia e la distribuzione di una parte dei TEP analizzati e nello stesso tempo non garantisce una completa rimozione dell’artefatto decay. Al contrario, a seguito della correzione col nostro algoritmo (condizione ALG), l’ampiezza, la morfologia e la distribuzione dei TEP rimanevano fedeli a quella originale, con una rimozione pressoché completa dell’artefatto decay. Il principale contributo di questo studio è stato la proposta di un nuovo algoritmo di correzione per un artefatto a lunga latenza che la TMS induce sul segnale EEG (artefatto decay) rendendo difficoltosa l’analisi. I risultati hanno dimostrato che questo metodo è più efficiente delle strategie attualmente in utilizzo in letteratura, non avendo i limiti intrinseci presentati dall’algoritmo ICA.