Development of nanocarriers with responsive interfacial properties for site-specific drug delivery

Alterazioni funzionali e morfologiche dell'endotelio vascolare del sistema linfatico, alterazioni micro-ambientali quali l'amplificazione del kit enzimatico, sovraespressione di recettori specifici, aumento del potenziale redox, temperatura e abbassamento del pH, sono caratteristiche tipiche dei tessuti tumorali. Queste caratteristiche possono essere sfruttate con successo per lo sviluppo di sistemi colloidali sopramolecolari in grado di direzionare passivamente o attivamente farmaci antitumorali al sito d'azione. In questo lavoro è stata indagata una nuova piattaforma liposomiale sensibile al pH per il direzionamento selettivo al tumore e assicurare l'accumulo del farmaco in concentrazione terapeutica adeguata. I liposomi sono stati decorati con un nuovo promotore di internalizzazione cellulare non-peptidico che simula l'azione dei peptidi naturali conosciuti dagli studi di letteratura. È stata messa a punto una nuova procedura di sintesi per ottenere il derivato dendronico oligoargininico da includere nel doppio strato lipidico dei liposomi. Il derivato TetraBoc-Arg (PBF) - [G-2] -distearoil glicerolo (Arg4-DAG) è costituito da un nucleo centrale di poliestere a cui le arginine sono state coniugate su un lato e che è stato terminato con una catena distearoil glicerolo dall'altro. La macromolecola risultante possiede un carattere anfifilico in virtù delle sue due frazioni combinate: 1) la coda idrofoba distearoil, elemento lipidico di ancoraggio per associazione al doppio strato lipidico, 2) la carica positiva conferita dalle arginine periferiche, che mimano i residui amminoacidici fondamentali del peptide TAT, conferendo così l'attività biologica del sistema. Gli intermedi e il prodotto finale sono stati caratterizzati da 1H, 13C NMR e spettrometria di massa. I liposomi ottenuti con un rapporto molare 2:1 HSPC/colesterolo sono stati generati con crescente rapporto del CPE rispetto ai lipidi, utilizzando la tecnica di ‘post-insertion’, che ha determinato l'aumento del potenziale zeta dei liposomi da +8 mV a +24 mV, all’aumentare del rapporto di CPE dall'1% al 4%, raggiungendo quindi il plateau. Le proprietà biologiche dei liposomi rivestiti con il CPE fluorescente sono state studiate su cellule tumorali HeLa. L’analisi citofluorimetrica e lo studio di microscopia confocale hanno confermato l'elevata capacità dei liposomi di associare con le cellule. Rispetto al liposomi nudi, è stata rilevata una maggiore efficienza di associazione alla cellula tumorale di 30 volte. I liposomi rivestiti col CPE hanno dimostrato una notevole capacità di veicolare albumina e calceina nel citosol. BSA è stata scelta come proteina modello, mentre calceina è stata scelta perché è una molecola fortemente idrofila, in modo da simulare il comportamento di farmaci idrosolubili. Entrambe le molecole sono state incorporate nel nucleo idrofilo di liposomi. La calceina non è stata rilasciata dai liposomi per almeno 16 giorni, mentre BSA è stata completamente rilasciata in 7 giorni. Al fine di conferire ai liposomi responsività ad alterazioni di pH per l'accesso controllato alle cellule tumorali, è stato sintetizzato un polimero sensibile, pH mPEG-oligosulphadimethoxine (mPEG5kDa-SDM8), mediante polimerizzazione radicalica di sulfadimetossina metacrilato su una catena di 2-bromo-isobutirril-methoxyPEG (MPEG-Br ) 5kDa. mPEG5kDa-SDM8 possiede un pKa di 7,12 che garantisce uno stato deprotonato con carica negativa a pH fisiologico (7.4) e uno stato neutro protonato a pH 6,5, che corrisponde all'ambiente tumorale. L’analisi di potenziale Zeta eseguita su liposomi decorati con Arg4-DAG e con il polimero mPEG5kDa-SDM8 ha confermato che la capacità di schermatura/deschermatura più finemente regolata si ottiene quando i due moduli sono equimolari, entrambi a 4% in moli rispetto al lipidi. Questa formulazione è risultata stabile anche in presenza di proteine ​​del siero, che non alterano l'interazione carica-carica tra l'oligo-sulfadimetossina del pH del polimero reattivo e oligo-arginine del CPE come osservato mediante analisi potenziale zeta. Anche lo studio SPR ha confermato questo risultato, dimostrando l'associazione del polimero con i liposomi rivestiti col CPE a pH 7.4 e il rilascio a pH 6,5, che corrisponde ad una peghilazione fisica reversibile in condizioni controllabili. Infine, gli studi biologici hanno confermato la capacità del polimero pH sensibile di schermare il CPE sulla superficie liposomiale in condizioni fisiologiche (pH 7,4), che impedisce l'internalizzazione delle vescicole non responsive al pH sia non caricate, sia caricate con calceina, mentre il polimero espone il CPE sulla superficie dei liposomi in presenza di un ambiente acido che simula il tumore, consentendo l'ingresso ai liposomi nelle cellule e la veicolazione del loro contenuto a livello intracellulare.