Two perspectives to consider Nucleic Acids

Dal giorno della loro scoperta, più di un secolo fa, gli acidi nucleici sono stati analizzati e studiati approfonditamente in tutti i loro aspetti, cercando di svelare gli ancora numerosi segreti nascosti nella loro struttura per comprenderne appieno le funzioni. Il ruolo più comunemente associato ad essi è sicuramente quello di trasportatori dell’informazione genetica ma numerose evidenze sperimentali ne confermano il coinvolgimento in una serie di altri processi meno noti. Gli acidi nucleici non devono perciò essere concepiti come strutture rigide e passive, ma come molecole dinamiche e attive, in grado di assumere numerose strutture tridimensionali. È proprio la conformazione spaziale che assumono gli acidi nucleici, codificata nella loro sequenza nucleotidica, che determina l’interazione specifica e selettiva con un bersaglio molecolare. Questo lavoro è essenzialmente diviso in due parti ed è finalizzato alla comprensione della duplice natura degli acidi nucleici, sviluppando due aspetti differenti ma complementari legati ad essi. Essendo correlati a numerosi eventi cellulari, gli acidi nucleici rappresentano un ottimo target per lo sviluppo di nuovi farmaci e allo stesso tempo, svolgendo un ruolo attivo nel riconoscimento di elementi proteici, gli acidi nucleici possono essere sviluppati come agenti diagnostici. La prima parte del mio lavoro di dottorato fa parte di un ampio progetto volto a identificare potenziali agenti antivirali, la cui azione può essere ricondotta all’inibizione dell’attività di NC mediante l’interazione diretta con il DNA e l’RNA virali. NC svolge numerose funzioni durante il ciclo replicativo di HIV-1 ed in particolare, grazie all’attività di chaperone, promuove varie reazioni di annealing nel processo di retrotrascrizione. Piccole molecole che siano in grado di riconoscere gli acidi nucleici virali coinvolti in questi passaggi possono essere considerati potenziali inibitori del ciclo replicativo di HIV-1, poiché in grado di interferire con l’attività di NC. La proteina ricombinante NC, full-length, e la sua attività biologica sono state caratterizzate: l'analisi della struttura di NC è stata completata mediante dicroismo circolare (CD). L'attività chaperonica di NC cioè la sua capacità di destabilizzare le strutture secondarie di TAR e cTAR è stata valutata utilizzando un saggio di fluorescenza e un saggio FRET; l’attività aggregante di NC è stata invece monitorata attraverso gel elettroforesi e ci ha permesso di analizzare la reazione di formazione dell’ibrido TAR/cTAR in presenza della proteina NC. È stata quindi studiata la capacità di composti di interferire sull’attività chaperonica di NC: è stato ottimizzato un saggio FRET che è risultato semplice, veloce e altamente riproducibile per l’High Throughput Screening (HTS) di inibitori di NC. È stato possibile analizzare più di cento composti appartenenti a famiglie chimiche molto diverse, ma in questo lavoro ci siamo concentrati su piccole molecole con attività intercalante. Gli antrachinoni 2,6-dipeptidil sostituiti, noti leganti di DNA e RNA, sono stati analizzati come potenziali inibitori di NC: essi potrebbero interferire con l’attività chaperonica di NC stabilizzando le strutture secondarie di DNA e RNA coinvolte nel processo di retrotrascrizione. Gli antrachinoni delle serie Z, GSF e G sono stati analizzati mediante HTS e i valori di IC50 nei confronti di TAR e cTAR sono stati determinati per ciascun composto. Tutti gli antrachinoni testati sono attivi sia su TAR che su cTAR: il meccanismo d’azione proposto per questi composti è stato quindi approfondito mediante saggi di Melting (sonde FRET accoppiate ad esperimenti di melting). Abbiamo analizzato la capacità di ciascun composto di legare e stabilizzare le strutture secondarie rispettivamente di TAR, cTAR e dell’ibrido TAR/cTAR. I risultati ottenuti mediante saggi di Melting supportano i risultati ottenuti mediante HTS, poiché i composti maggiormente attivi come inibitori di NC sono risultati anche dei potenti stabilizzanti di TAR e cTAR. Infine, abbiamo analizzato, mediante gel elettroforesi, l’effetto degli antrachinoni più promettenti sulla reazione di formazione dell’ibrido mediata da NC, per confermare la correlazione tra inibizione dell’attività chaperonica di NC e l’immediatamente successiva formazione dell’ibrido. Tutti gli antrachinoni testati sono risultati inibitori della formazione dell’ibrido TAR/cTAR, in accordo con i risultati di HTS. Quindi, acidi nucleici virali coinvolti nella retrotrascrizione rappresentano un nuovo e validato bersaglio per lo sviluppo di farmaci anti-HIV e gli antrachinoni 2,6-dipeptidil sostituiti sono stati identificati come composti attivi anti-NC che potrebbero essere sviluppati come potenziali agenti antivirali. Inoltre, una promettente classe di potenziali anti-HIV è rappresentata da composti che interferiscono con il processo di trascrizione, Tat-mediato, del ciclo replicativo virale. Due classi di composti sono state studiate come inibitori della formazione del complesso Tat-TAR. I chinoloni sono una nota classe di farmaci anti-HIV che interferiscono con il processo di trascrizione mediata da Tat. Per fornire nuove informazioni SAR (Structure-Activity Relationship) sui chinoloni antivirali, le serie WP e HP sono state analizzate mediante test di Fluorescence Quanching (FQA), una piattaforma di screening basata su saggi FRET che ha permesso la determinazione della costante di inibizione Ki per ciascun composto. Tutti i 6-DFQs della serie WP testati sono attivi come inibitori della formazione del complesso Tat-TAR, con valori di Ki inferiori rispetto al controllo WM5. La serie WP differenzia dal controllo per modifiche introdotte nella posizione N1: tali modifiche sembrano migliorare l'attività dei chinoloni WP come inibitori Tat-TAR. La seconda classe di composti testati come inibitori Tat-TAR è costituita da acido ellagico e alcuni derivati sintetici bi-e mono-lattoni (ELs). Non è stato possibile analizzare gli ELs mediante FQA, e l’analisi è stata quindi eseguita mediante EMSA. Il composto 1186 è un buon inibitore della formazione del complesso Tat-TAR e questo risultato perciò supporta l’ipotesi di sviluppare gli ellagici come potenziali antivirali. La seconda parte del mio lavoro di ricerca è focalizzata sull'ottimizzazione, sviluppo e caratterizzazione di un nuovo sistema sensoristico per la rilevazione di proteine coinvolte in malattie, con interesse diagnostico e terapeutico. Biosensori basati sull'uso di aptameri per il riconoscimento specifico di un analita sono chiamati "aptasensori". Abbiamo sviluppato un Sandwich Aptamer Microarray (SAM) con lo scopo di sostituire i tradizionali sistemi immunochimici utilizzati in diagnostica. SAM è un sistema simil-ELISA, che usa un'architettura simile, ma è totalmente basato sulla tecnologia degli aptameri: un "aptamero primario" è utilizzato come elemento di selezione e un "aptamero secondario" come trasduttore del segnale. Aptameri di DNA che riconoscono differenti esositi della proteina target vengono utilizzati in tandem per il riconoscimento simultaneo della proteina bersaglio. Il primo target proteico è costituito dalla trombina. Sono noti e ben caratterizzati due aptameri di DNA che legano la trombina in esositi diversi: TBA1 lega il sito di riconoscimento del fibrinogeno, mentre TBA2 lega la trombina a livello del sito di riconoscimento dell’eparina. Gli aptameri sono stati opportunamente modificati per l’ancoraggio alla superficie solida e per la rilevazione del segnale di fluorescenza. Un’analisi estensiva in soluzione della formazione dei complessi binari e ternari aptameri-proteina è stata effettuata mediante EMSA, per verificare se in soluzione le modifiche chimiche introdotte compromettono il riconoscimento della proteina da parte degli aptameri. Poi, è stata verificata la formazione del sandwich in fase solida. SAM è risultato efficace e specifico, e diversi aptameri secondari e diversi metodi di rilevazione possono essere utilizzati. L'utilizzo del metodo indiretto (TBA2-biotina più streptavidina-Cy3) permette di raggiungere LOD e LOQ inferiori rispetto a TBA2-Cy5 (metodo diretto) anche in presenza di fluidi biologici. Il secondo target proteico che è stato utilizzato è il VEGF165: due aptameri di DNA anti-VEGF sono stati recentemente selezionati. Seguendo lo stesso approccio adottato per la trombina, la coppia di aptameri modificati che assicura la formazione a sandwich è stata identificata in soluzione e il sistema è stato poi applicato in fase solida. I risultati ottenuti sono positivi e coerenti con i risultati ottenuti dall'analisi in soluzione. SAM, sviluppato per la detection della trombina e del VEGF, rappresenta un potenziale mezzo per monitorare i livelli di proteina nel plasma o nel sangue e dimostra quindi la potenzialità dell’uso degli aptameri in campo clinico e diagnostico.