Utilizzo di Nanoporous Silica Chip nello studio del profilo peptidico plasmatico: applicazione nello sviluppo e progressione del cancro colorettale

Background: Per la ricerca di biomarcatori proteici, l’approccio basato sulla identificazione di un singolo marcatore hanno, finora, dimostrato l’incapacità di individuare inequivocabilmente il cancro, in parte perché gli attuali biomarcatori tumorali sono anche espressi nelle cellule normali. Il profilo proteico si basa, invece, sulla rilevazione di pattern identificativo di centinaia di proteine in un alto numero di campioni. Il contenuto informativo più alto sembra risiedere nelle proteine/peptidi a basso peso molecolare (LMW), la frazione meno abbondante nei fluidi biologici, che sembrano rispecchiame meglio gli stati fisiopatologici dei tessuti. Per l’analsi in spettrometrometria di massa e’ necessario selezionare e arrichire questa frazione del plasma. Scopo: Si è focalizzato sull'utilizzo di un dispositivo nanoporoso (Nanoporous Silica Chip, NSC) per il recupero della frazione a basso peso molecolare da plasma, in campioni di pazienti con cancro colorettale (CRC) a vari stadi di progressione tumorale e sullo studio del relativo profilo peptidico mediante tecnica MALDI-TOF. Materiale e metodi: NSC è un prototipo creato e brevettato dal Laboratorio del Prof. M. Ferrari (Dip. di Nanomedicina presso The Methodist Hospital Research Institute, Houston, TX, USA) costituito da un supporto in silicone, di circa 10cm, rivestito da un sottile strato di silice con una struttura a nano-pori. È stato necessario lo sviluppo di un protocollo semplice e veloce di frazionamento dei peptidi plasmatici. Il protocollo standardizzato è stato applicato per il frazionamento di campioni di plasma di 34 soggetti sani (controlli), 27 con lesione pre-cancerosa (adenoma) e 33 con CRC a stadio precoce (stadio I-II) e 34 con CRC a stadio tardivo (stadio III-IV). La frazione ottenuta è stata analizzata con spettrometria di massa MALDI-TOF e i dati calibrati, allineati e normalizzati sono stati sottoposti ad attenta e accurata analisi statistica univariata e multivariata con lo scopo di identificare differenze nel profilo peptidico plasmatico nei diversi gruppi di soggetti. Risultati: Si è ottenuta una buona classificazione dei controlli rispetto ai pazienti, ma una scarsa distinzione tra i gruppi di soggetti con adenoma, CRC con stadio precoce e tardivo. Da tale analisi, si sono individuate alcune specie ioniche rappresentate con diversa intensità nei vari gruppi, che sono state sottoposte a identificazione della sequenza amminoacidica mediante MALDI-TOF/TOF. Sono risultate essere tutte frammenti peptidici di proteine plasmatiche appartenenti alla risposta infiammatoria e al sistema del complemento. In particolare i frammenti peptidici del C3f e C4-A/B sembrano originare dal proprio precursore a seguito di tagli enzimatici a carico di endoproteasi ed esoproteasi. La presenza di alcuni di questi frammenti è risultata essere variabile nei gruppi in esame. Inoltre si è identificato un interessante frammento peptidico che deriva dal propeptide di ITIH4 (Inter-?-trypsin inhibitor heavy chain H4), una proteina di fase acuta secreta dal fegato e coinvolta nello sviluppo e rigerazione epatica. Una ricerca bibliografica ha identificato che frammenti di ITIH4, possono essere possibili biomarcatori per vari stati patologici come infarto e cancro alla mammella e prostata. Conclusioni: La metodica ottimizzata è semplice e veloce e NSC è un dispositivo con ampie potenzialità di utilizzo. È necessario approfondire lo studio sul particolare pattern proteolitico di peptidi ottenuti, che suggerisce il coinvolgimento di un'attività esoproteasica ben distinta e la presenza di proteasi specifiche del tumore del colon-retto.