Examining the influence of the endogenous small RNAs on gene expression and genome stability in the maize leaf

I piccoli RNA non codificanti sono stati riscontrati in tutti i regni della vita (Michaux et al. 2014). Essi partecipano ai meccanismi di regolazione genica di silenziamento del DNA mediato da RNA, che si distinguono in meccanismi di silenziamento genico trascrizionale (TGS) e post-trascrizionale (PTGS). Non tutti questi pathway sono conservati negli organismi, come ad esempio il meccanismo chiamato di metilazione del DNA RNA-dipendente (in inglese ‘RNA-directed DNA methylation’, RdDM). Esso avviene nel nucleo, dove induce la repressione delle sequenze target a livello trascrizionale. Il pathway RdDM è un esempio di meccanismo epigenetico di controllo dell’espressione genica, in quanto la variazione di espressione viene indotta senza alterazioni di sequenza del DNA, attraverso modificazioni della cromatina guidate dall’azione dei piccoli RNA, come ad esempio la metilazione delle citosine o le modifiche istoniche. Nelle piante il pathway RdDM prevede l’azione di due RNA polimerasi specifiche del regno vegetale, l’RNA polimerasi IV (Pol IV ) e l’RNA polimerasi V (Pol V) (Matzke and Mosher 2014). La specificità di questi enzimi riservata al regno vegetale è indice che le piante hanno evoluto un livello aggiuntivo di complessità dei meccanismi di silenziamento del DNA RNA-dipendenti, che sono stati studiati soprattutto nella pianta modello Arabidopsis thaliana (abbreviata d’ora in poi con il nome Arabidopsis). I piccoli RNA e i meccanismi di silenziamento del DNA RNA-dipendenti ricoprono ruoli fondamentali in diversi processi biologici. In particolare, il loro coinvolgimento nei fenomeni quali il vigore dell’ibrido, la risposta allo stress e la formazione di epialleli li rende un’importante fonte di studio al fine del miglioramento delle piante da coltivazione. Il genoma della pianta Arabidopsis presenta molteplici differenze in termini di dimensione, struttura ed organizzazione dinamica rispetto ai genomi delle piante da coltivazione. Queste differenze sostanziali rendono necessario, ma anche difficoltoso, il trasferimento delle conoscenze acquisite in Arabidopsis da questa pianta modello alle piante da coltivazione (Mirouze and Vitte 2014). Il mais è una delle più importanti coltivazioni a livello mondiale per la produzione di alimenti e mangimi e viene utilizzato in diverse catene industriali. Il suo genoma possiede caratteristiche uniche, come ad esempio la presenza di un inusuale elevato numero di elementi trasponibili attivi (Lisch D 2012), che sono i principali target del pathway RdDM. Per queste ragioni è di particolare importanza la ricerca scientifica volta ad aumentare la conoscenza dei meccanismi di controllo dell’attività del genoma di mais guidati dai piccoli RNA. L’attività del progetto di Dottorato si inserisce all’interno di questo quadro di ricerca. Il principale scopo del progetto è stato la caratterizzazione della popolazione di piccoli RNA endogeni in foglia di mais, in termini di annotazione genomica e abbondanza, che ha permesso poi di valutare gli effetti dei piccoli RNA sull’espressione genica e la loro risposta a stress abiotici. Al fine di indagare il controllo esercitato dai piccoli RNA sull’espressione genica sono state studiate due linee di mais, la linea inbred B73 e il mutante rmr6-1. Questo mutante presenta una forma non funzionale della Pol IV che provoca la mancata produzione dei piccoli RNA che partecipano al pathway RdDM e che dipendono dalla Pol IV per la loro biogenesi, i quali sono chiamati siRNA, dall’inglese ‘small interfering RNA’ (Erhard et al. 2009). L’assenza dei siRNA ha permesso di valutarne gli effetti sulla stabilità del genoma. La popolazione dei piccoli RNA è stata caratterizzata attraverso l’analisi di dati di sequenziamento di piccoli RNA ottenuti dai nostri campioni. L’annotazione dei geni e i loro livelli di espressione sono stati ottenuti nel nostro laboratorio attraverso l’analisi di dati di sequenziamento di RNA totale proveniente dagli stessi campioni. Al fine di valutare il ruolo dei piccoli RNA nella risposta allo stress la loro espressione è stata analizzata in piante wild type e mutanti sottoposte a stress abiotici. I protocolli di stress utilizzati sono stati trattamenti che mimano gli episodi di stress idrico, salino e la combinazione dei due, idrico più salino, che si verificano in condizioni di campo. Sono stati scelti questi stress abiotici in quanto sono le tipologie di stress più frequenti che abbassano le rese della produzione delle piante da coltivazione a livello mondiale (Munns R 2011). In particolare, la salinizzazione costituisce un problema anche nelle zone costiere del Mediterraneo (Flowers TJ 2004) e, a livello della regione Veneto, nei suoli costieri della laguna di Venezia (Carbognin and Tosi 2003). Il lavoro del Dottorato è iniziato con la partecipazione ad un progetto di collaborazione tra i laboratori della Prof.ssa S. Varotto, del Prof. F. Morari e del Dr. F. Meggio. Lo scopo del progetto è stato la messa a punto di un protocollo riproducibile per l’applicazione di stress idrico, salino e idrico più salino in combinazione a piante di mais, che fosse realistico a livello agronomico e quindi simile alle condizioni di stress che avvengono in campo. Al fine di mimare gli episodi stress progressivo che si verificano in campo, gli stress idrico, salino e la loro combinazione sono stati applicati alle piante in modo progressivo per dieci giorni e la risposta delle piante allo stress è stata esaminata in diversi momenti durante la sua applicazione. In condizioni di campo solitamente accade che dopo un episodio di stress le condizioni ambientali tornino favorevoli, quindi dopo i dieci giorni di applicazione di stress quest’ultimo è stato rimosso e le piante sono state cresciute in condizioni ottimali per valutarne la capacità di recupero dallo stress. Due diverse linee di mais sono state esaminate: la linea inbred B73 sensibile agli stress e un ibrido commerciale F1 selezionato per la sua resistenza agli stress. In diversi momenti durante l’applicazione dello stress e poi durante la fase di recupero dallo stress la risposta delle piante è stata valutata attraverso l’analisi di parametri agronomici, fisiologici e genetici. I parametri agronomici sono stati studiati dal laboratorio del Prof. F. Morari e i parametri fisiologici dal Dr. F. Meggio. L’attività svolta nel lavoro di Dottorato ha riguardato lo studio della risposta delle piante a livello genetico. In particolare, sono stati cercati in letteratura geni per i quali fosse nota l’espressione differenziale in seguito agli stress studiati o l’appartenenza alle principali vie molecolari di risposta a stress abiotici. Il loro livello di espressione è stato studiato nei nostri campioni attraverso la tecnica della PCR quantitativa in real-time. Tutti i parametri analizzati hanno confermato che i trattamenti sono stati efficaci nell’indurre la condizione di stress nelle piante. Di conseguenza, il protocollo messo a punto costituisce un valido strumento per studi successivi riguardanti la risposta di piante di mais a questi stress, i cui risultati mantengano validità in caso di applicazione in campo agronomico. Lo studio combinato dei parametri agronomici, fisiologici e genetici ha permesso di approfondire i meccanismi che regolano la diversa tolleranza allo stress delle due linee di mais studiate. Il lavoro principale del Dottorato ha riguardato l’analisi bioinformatica di dati di sequenziamento di piccoli RNA, ottenuti da piante wild type e mutanti rmr6-1, con lo scopo di caratterizzare la popolazione dei piccoli RNA endogeni della foglia di mais, esaminarne gli effetti sull’espressione genica e la risposta a stress abiotici. 48 librerie di piccoli RNA sono state sequenziate da campioni di foglia di piante wild type e mutanti, cresciute in condizioni di controllo, in condizioni di stress abiotici e di recupero dallo stress. Le sequenze ottenute sono state pre-processate e la loro qualità è stata inizialmente verificata. Dopodiché esse sono state allineate al genoma di B73 e le sequenze allineate hanno mostrato il tipico profilo dei piccoli RNA di mais: i più abbondanti con lunghezza di 24-nt, seguiti da quelli con lunghezza di 22-nt e poi di 21-nt. Il progamma bioinformatico ShortStack è stato utilizzato per identificare de novo i loci genomici responsabili di una produzione significativa di piccoli RNA in foglia di mais, partendo dall’insieme di tutte le sequenze prodotte dai 48 campioni sequenziati. I loci MIRNA identificati sono stati i primi a essere analizzati. Sono state riscontrate delle differenze tra la nostra annotazione prodotta dei microRNA e quella riportata nel database miRBase, le quali potrebbero riflettere un’inaccurata annotazione presente in miRBase o differenze specifiche della foglia nel processamento dei precursori dei microRNA. La predizione dei target dei microRNA è stata eseguita sui trascritti annotati nel trascrittoma di mais ricostruito dai dati di sequenziamento di RNA totale. Un trascritto nuovo annotato è stato predetto come target di un microRNA di mais che è conservato in diverse specie vegetali, aiutando a capire la funzione di questo microRNA in mais. Nuovi putativi microRNA sono stati identificati: una parte di essi ha presentato le caratteristiche per essere considerati microRNA bona fide, invece altri hanno presentato caratteristiche tipiche dei 'proto-miRNA' o dei siRNA. Le altre categorie identificate di loci di piccoli RNA sono state analizzate in termini di co-occupancy con i geni codificanti proteine, con i trascritti di trasposoni e con i lunghi RNA non codificanti (lncRNA). I loci con produzione primaria di piccoli RNA di 24-nt di lunghezza sono stati trovati significativamente arricchiti nelle regioni fiancheggianti di tutte e tre le tipologie di geni considerate. In particolare, i geni espressi hanno mostrato una maggiore probabilità di essere fiancheggiati da loci di piccoli RNA di lunghezza di 24-nt rispetto ai geni non espressi. Nel mutante rmr6-1, nonostante la perdita sostanziale dei siRNA osservata soprattutto nelle regioni fiancheggianti dei geni, un totale di 1013 geni sono stati trovati differenzialmente espressi (DE) rispetto al wild type e la downregolazione di un locus di piccoli RNA non è risultato in generale un criterio sufficiente e nemmeno necessario per predire la up o downregolazione del suo gene vicino. Di conseguenza, l’assenza dei siRNA non ha mostrato avere un grosso impatto nella stabilità del genoma in foglia di mais, infatti, le foglie del mutante non hanno evidenziato difetti morfologici e sono state osservate essere identiche a quelle delle piante wild type. I meccanismi coinvolti nel mantenimento del silenziamento genico quando i siRNA non sono presenti e il pathway RdDM è alterato nella sua funzione rimangono ancora sconosciuti. Dati di letteratura evidenziano la possibilità che il pathway RdDM sia essenziale per garantire la trasmissione transgenerazionale dell’informazione epigenetica. In questa ipotesi, al fine di approfondire il ruolo dei siRNA nel controllo dell’espressione genica, risulterebbe informativo lo studio dell’attività dei siRNA e delle mutazioni del pathway RdDM in altri tipi cellulari, ad esempio i gameti. Risulterebbe informativo anche lo studio delle variazioni epigenetiche di espressione genica in generazioni successive di piante. La mancanza dei siRNA, nonostante sia stato verificato non compromettere la stabilità del genoma nella foglia, è stato osservato indurre cambiamenti di espressione genica che sono apparsi come effetti secondari della mutazione. In particolare, nel mutante rmr6-1 è stata registrata l’upregolazione di geni di risposta allo stress e di geni codificanti citocromi e la downregolazione di geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare e di geni codificanti proteine istoniche. Infine è stata esaminata la risposta allo stress dei piccoli RNA. Sono stati applicati i trattamenti di stress precedentemente messi a punto ed è stato identificato un piccolo numero di microRNA e loci di piccoli RNA delle altre categorie differenzialmente espressi in condizioni di stress. Nonostante questo numero sia risultato inferiore rispetto a quello trovato in precedenti lavori che hanno analizzato la risposta dei piccoli RNA allo stress, i piccoli RNA DE identificati potrebbero essere candidati migliori per studi di tolleranza allo stress, in quanto la loro espressione differenziale è stata indotta da condizioni di stress simili a quelle che si verificano in campo. I lavori qui citati sono riportati nella bibliografia del secondo capitolo di questa tesi