BTBD7, a gene identified with a transposon based forward genetic screening, is important for colorectal cancer metastasis

Il tumore del colon-retto è il secondo tumore più letale a causa della diffusione metastatica della lesione primaria. Un’ipotesi attuale è che la metastasi sia basata sulla transizione epitelio-mesenchimale (in inglese EMT, epithelial to mesenchymal transition), un processo biologico in cui le cellule epiteliali perdono gradualmente i loro caratteri epiteliali per convertirsi a un programma di tipo mesenchimale. I saggi in vitro che selezionano cellule EMT sono fondamentali per poter fare screening genetici che selezionano cellule che si sono convertite al programma EMT. Ad esempio, il saggio in vitro di anoikis si basa sulla crescita delle cellule in condizioni di mancanza di attacco alla matrice ed è stato usato per selezionare cellule con fenotipo più aggressivo; tuttavia alcuni tipi di cellule tumorali sono capaci di resistere a queste condizioni di crescita rafforzando i contatti cellula-cellula, un comportamento in netto contrasto con il fenotipo EMT. Un saggio in vitro sviluppato nel nostro laboratorio, denominato forced Single Cell Suspension assay (fSCS) si è rivelato più stringente rispetto al saggio in vitro di anoikis e seleziona cellule andate incontro alla EMT. La parte non codificante del genoma, nonostante abbia un ruolo fondamentale nella regolazione della EMT e nella metastasi (come avviene ad esempio per i miRNA), risulta molto meno studiata rispetto alla controparte codificante. I saggi genetici in vitro basati sull’uso di trasposoni interrogano il genoma in modo più randomico rispetto ad altri tipi di saggi (ad esempio quelli basati sull’uso di retrovirus). Per avvalerci di un saggio in vitro che consenta uno screening molto efficiente dei geni che regolano la EMT, abbiamo combinato il saggio di fSCS con uno screening genetico in vitro basato sull’uso del trasposone Sleeping Beauty in cellule di cancro colo-rettale HCT116. Abbiamo identificato un clone cellulare, TN4_20, che mostra le seguenti caratteristiche: maggior resistenza al saggio di fSCS, morfologia mesenchimale, espressione di marcatori della EMT (ad esempio Slug ↑, Twist ↑, Vimentin ↑, E-cadherin ↓, Has-2 ↑), e abilità di generare un maggior numero di colonie satelliti nel saggio di evasione in matrigel. Inoltre, in un esperimento pilota condotto in vivo, le cellule TN4_20, iniettate in topi mediante iniezione intra-cecale, formano metastasi a distanza. Dopo essere risaliti alle posizioni genomiche delle inserzioni del trasposone nel DNA genomico delle TN4_20, ci siamo focalizzati sull’inserzione localizzata nella 3’UTR (3’ regione non tradotta) del gene BTBD7. Abbiamo scelto di studiare questa inserzione perché BTBD7 è un noto regolatore di EMT e metastasi e perché questa inserzione del trasposone è localizzata nel sito bersaglio predetto del miR-23b, un miRNA con note funzioni anti-metastatiche. Abbiamo ipotizzato e dimostrato che il miR-23b bersaglia il gene BTBD7 e i nostri dati suggeriscono che l’inserzione del trasposone nella 3’UTR di BTBD7 interferisce con questa interazione. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’interazione tra il miR-23b e BTBD7 è importante per la resistenza all’ fSCS. I nostri risultati inoltre dimostrano che il silenziamento di BTBD7 interferisce con la resistenza all’ fSCS sia in cellule HCT116 parentali che TN4_20, e che la over-espressione di un costrutto ectopico eGFP-Btbd7 in cellule HCT116 parentali conferisce resistenza all’ fSCS e l’abilità di generare un maggior numero di colonie satelliti nel saggio di evasione in matrigel. Inoltre, l’over-espressione di eGFP-Btbd7 induce una riduzione dei livelli di trascritto e di proteina di E-caderina, e un aumento dei livelli di Vimentina, entrambi marcatori di EMT. In più, la over-espressione di eGFP-Btbd7 aumenta i livelli di trascritto e di proteina del fattore di trascrizione Zeb-1. In una versione estesa del nostro saggio, attraverso l’esecuzione di round multipli di fSCS sia in cellule HCT116 parentali che in cellule HCT116 trasposte con il trasposone Piggybac (PB), abbiamo ottenuto gruppi, e non singoli cloni, di cellule resistenti all’ fSCS. Abbiamo osservato che cellule che sopravvivono a ogni round di fSCS generano un maggior numero di colonie sopravviventi, le quali acquisiscono una morfologia più mesenchimale. Inoltre, le colonie di cellule sopravvissute all’ fSCS mostrano ridotti livelli di espressione di E-caderina, aumentati livelli di espressione di Vimentina, e un aumentato numero di cellule con ridotta espressione di EpCAM, suggerendo che round multipli di fSCS determinano un arricchimento di cellule con tratti di EMT e staminalità. Inoltre, abbiamo osservato che cellule resistenti all’fSCS mostrano una maggiore resistenza al trattamento con 5-fluororacile (5-FU) e un aumentato potenziale metastatico in vivo. Infine, round ripetuti di fSCS arricchiscono due famiglie di miRNA, cioè miR-30 e miR-302, che sono già stati descritte avere un ruolo nella EMT e nella metastasi, e che potrebbero quindi regolare anche la resistenza all’ fSCS.