Sviluppo di un metodo accurato per l'identificazione e genotipizzazione del papillomavirus umano basato sul sequenziamento 454 di nuova generazione

Un' accurata tipizzazione di HPV è essenziale per la valutazione e il monitoraggio della vaccinazione, come test di secondo livello nello screening del carcinoma cervicale e per le indagini epidemiologiche. In questo studio, è stato messo a punto e testato su campioni clinici un nuovo metodo di tipizzazione di HPV basato sul sequenziamento 454 next-generation (NGS) dell' amplicone L1 di HPV. A tale scopo è stato sviluppato un primo protocollo che utilizzava dei primer ottenuti modificando i primer degenerati MY09/11; tale protocollo è stato testato su 164 campioni citologici cervicali fornendo una prima dimostrazione che il NGS può essere utilizzato per la tipizzazione di HPV. Il protocollo presentava però alcuni limiti legati soprattutto al disegno dei primer. E' stato quindi studiato un secondo protocollo. Tale protocollo utilizzava un set di primer PGMY modificati in modo da ottenere sensibilità migliorata per alcuni tipi di HPV che non erano riconosciuti dai primer PGMY standard. Usando una median coverage di 12,000-fold, il metodo NGS è arrivato a identificare correttamente tutti i tipi di HPV ad alto rischio sia in infezioni singole che multiple, con una sensibilità di 50 genomi equivalenti, come dimostrato testando il pannello di campioni del WHO LabNet EQA. L' analisi di miscele di linee cellulari positive per HPV16 e per HPV18 ha dimostrato che il metodo NGS può quantificare in modo riproducibile la proporzione con cui ogni tipo virale è presente nelle infezioni multiple con un ampio range. Nell'analisi di campioni clinici il metodo NGS ha identificato correttamente un ampio numero di tipi di HPV nelle infezioni multiple ed è stato anche utile nell'analisi di campioni cervicali con risultati discordanti al test hybrid capture 2 e line probe assays. Il metodo ha permesso inoltre di riconoscere la presenza di varianti intratipo (sostituzioni nucleotidiche) nello stesso campione clinico. In conclusione, è stato messo a punto un nuovo metodo di tipizzazione dell' HPV basato sul pirosequenziamento 454. Questo metodo è sensibile, specifico, quantitativo, e preciso sia nelle infezioni singole che nelle infezioni multiple. Permette inoltre di identificare un ampio range di tipi di HPV e potenzialmente consente di scoprire nuovi tipi di HPV e varianti.