Neuroeffector coupling in the heart: determinants of function and survival of cardiac sympathetic neurons

Razionale: ll sistema nervoso simpatico, componente del sistema nervoso autonomo (ANS), opera un continuo controllo della funzione e sulla struttura delle cellule cardiache. In condizioni basali, l’input neuronale ai cardiomiociti (CMs) del nodo seno-atriale (SAN) è responsabile della regolazione della frequenza cardiaca (HR) e, in parallelo, influenza l'equilibrio tra la sintesi e la degradazione proteica nei CM di lavoro, determinando così il trofismo cellulare (Zaglia et al., 2013). È anche comunemente noto che i neuroni simpatici (SNs) si attivano rapidamente dopo l’ esercizio fisico o dopo stress emozionali che caratterizzano la cosiddetta risposta "fight-or-flight", con conseguente aumento delle prestazioni cardiache massime attraverso effetti inotropici e cronotropici positivi (Li et al., 2000). Mentre questi meccanismi generali di regolazione della fisiologia del cuore sono comunemente riconosciuti e sono stati accuratamente studiati negli ultimi decenni sia nelle condizioni normali che in quelle patologiche (Franzoso et al., 2016), il rapporto tra la fine organizzazione della rete neuronale nel miocardio e la sua funzione, così come la biofisica della comunicazione neuro-cardiaca rimane in gran parte non nota. Scopo della tesi: Nei nostri studi iniziali, abbiamo utilizzato diversi metodi di imaging per indagare gli aspetti morfologici dell'innervazione del miocardio. I nostri risultati dimostrano che il cuore della maggior parte dei mammiferi, compresi gli esseri umani, è altamente innervato dalle fibre simpatiche, che si distribuiscono nelle varie regioni del cuore con un pattern ben conservato, specie-specifico e mostrano varicosità (ovvero siti di rilascio di neurotrasmettitori attivi) regolari a stretto contatto con le membrane dei CMs target. Inoltre, l'analisi ultrastrutturale ha dimostrato che tali contatti hanno caratteristiche simili a quelle descritte per la nota giunzione neuromuscolare (NMJ), che comprendono tra le altre, l'accumulo di mitocondri nelle varicosità "presinaptiche" (Slater, 2003; Levitan et al., 2015). Questi dati ci hanno spinto a studiare: i) la biofisica della comunicazione neurocardiaca, che è stata affrontata con modelli sia in vitro che in vivo, al fine di determinare il ruolo del contatto diretto intercellulare nelle dinamiche di accoppiamento neuro-cardiaco; ii) se la disfunzione nei mitocondri che si trovano nei SNs, valutata in un modello murino recentemente sviluppato nel laboratorio del mio PhD aploinsufficiente per la proteina Opa1 (Optic Atrophy Factor-1) (TOH-Opa1+/-), possa influenzare il controllo neurogenico del cuore. Risultati: i) Dinamiche dell'accoppiamento neuro-cardiaco a livello della “sinapsi cardiaca". Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare le dinamiche della comunicazione tra SN/cardiomiociti, sia mediante l'imaging di cAMP in tempo reale nei CMs in co-cultura che esprimono il sensore per la FRET Epac1, per analizzare le risposte dei CMs dopo l'attivazione dei SNs, e in vivo, utilizzando l’optogenetica in topi transgenici con espressione specifica di Channelrhodopsin-2 nei SNs. Abbiamo quindi dimostrato che i SN ed i cardiomiociti interagiscono in siti specifici sia nel cuore umano che nei roditori, sia in vitro nelle co-culture. In particolare, la depolarizzazione dei SNs ha causato un aumento del [cAMP] intracellulare che è stato rilevato solo nei CMs innervati, quindi la comunicazione tra CM e SN avviene in un dominio di segnalazione extracellulare con un’elevata concentrazione di noradrenalina ([NE]). Nel topo in vivo, l'attivazione, tramite l’optogenetica, dei SN cardiaci, che innervano il nodo seno-atriale, ha prodotto un istantaneo aumento della frequenza cardiaca, che ha accorciato l'intervallo tra due battiti con una precisione a singolo battito. La dose del β-bloccante propranololo, utilizzata per inibire l'effetto della fotoattivazione, era molto più alta di quella in grado di bloccare le catecolamine circolanti, indicando così che la neurotrasmissione simpatica nel cuore si verifica a concentrazioni localmente elevate di noradrenalina. I nostri dati in vitro e in vivo suggeriscono che il controllo della funzione cardiaca da parte dei SN, grazie alla creazione di uno specifico sito giunzionale intercellulare, si basa sulla comunicazione intercellulare "quasi-sinaptica". Le membrane strettamente affiancate dei neuroni e cardiomiociti delineano un dominio di segnalazione extracellulare che consente l'attivazione dei β-AR localizzati all'interno dello spazio giunzionale con elevate [NE]. Il volume ristretto di tale dominio consente a un singolo potenziale d'azione neuronale di rilasciare una [NE] sufficiente a innescare l'aumento di cAMP rilevabile nei cardiomiociti accoppiati. ii) Ruolo della proteina mitocondriale Opa1 nella regolazione della fisiologia dei neuroni simpatici cardiaci. Nello studio delle interazioni neuro-cardiache descritte in precedenza, siamo stati intrigati dall'osservazione che i mitocondri si accumulavano nelle varicosità dei SNs e specificamente si concentravano nello spazio attorno alla membrana presinaptica. I mitocondri nei neuroni sono fondamentali per molte funzioni cellulari, tra cui la neuro-esocitosi, il recupero del neurotrasmettitore ed il mantenimento del trofismo del processo neuronale, ma il loro ruolo specifico nei SN cardiaci è in gran parte inesplorato. Abbiamo quindi cercato di determinare se mitocondri disfunzionali compromettessero il controllo neurogenico del cuore. A questo scopo, abbiamo sfruttato un modello murino generato nel nostro laboratorio, caratterizzato dall’ aploinsufficienza del gene che codifica per la proteina Optic Atrophy Factor-1 (Opa1) (Hoppins et al., 2007), selettivamente nei SNs. Opa1 è una proteina chiave implicata nelle dinamiche mitocondriali e la sua carenza causa una malattia neurodegenerativa ereditaria caratterizzata dalla morte delle cellule ganglionari retiniche, nota come Atrofia ottica autosomica dominante (ADOA), con conseguente perdita visiva. È interessante notare che i pazienti affetti da ADOA presentano anche neuropatia periferica e anomalie del ritmo cardiaco (Spiegel et al., 2016), suggerendo l'ipotesi che i mitocondri disfunzionali possono influenzare non solo i neuroni centrali ma anche periferici e, in modo notevole, i neuroni autonomici che innervano il cuore (Yu-Wai Man et al., 2016). Per indagare questa ipotesi, ci siamo concentrati sull'innervazione simpatica cardiaca sia nei topi aploinsufficienti per Opa1 (TOH-Opa1+/-) adulti che vecchi, utilizzando saggi morfologici e funzionali. I nostri dati hanno dimostrato che l'aploinsufficienza di Opa1 porta ad una diminuzione della densità di SN cardiaci, che inizia nell'età adulta ma è anche presente durante l'invecchiamento. Questo è accompagnato da alterazioni nella morfologia e della distribuzione dei SN. La disinnervazione cardiaca nei topi TOH-Opa1+/- determina una significativa riduzione della variabilità della frequenza cardiaca e una maggiore propensione allo sviluppo di aritmie. Coerentemente, abbiamo rilevato una diminuzione della densità dei SN nelle biopsie cutanee ottenute da pazienti con ADOA, che progredisce durante l'invecchiamento. Quindi possiamo concludere che Opa1 è essenziale per l'omeostasi dei SN e indica che la sua aploinsufficienza porta alla loro degenerazione. Tale disinnervazione inoltre causa la disfunzione del controllo estrinseco del ritmo cardiaco. I meccanismi responsabili della degenerazione dei SN aploinsufficienti per Opa1 verranno valutati in vitro, con un focus sulla segnalazione mediata dall’ NGF. Per tradurre i nostri risultati nella patologia umana, analizzeremo il fenotipo dei SN nelle biopsie cutanee ottenute dai pazienti con ADOA. Conclusioni: Complessivamente, i dati di questi due progetti forniscono le basi per studi futuri finalizzati a definire se un' alterazione primaria nel contatto tra SN-CM contribuisca alla patogenesi di diversi disturbi cardiovascolari e al chiarimento dei meccanismi molecolari in cui un difetto nelle dinamiche mitocondriali possa provocare la degenerazione dei neuroni simpatici che innervano il cuore.