Outer membrane particles as Shigella vaccine candidate: generation, proteomic and immunoproteomic analysis

La Shigella è un batterio enterico Gram-negativo e rappresenta la principale causa di dissenteria nei neonati e nei bambini al di sotto dei 5 anni nei paesi in via di sviluppo. Il genere Shigella include 50 serotipi diversi distinguibili in base alla composizione saccaridica dell’antigene O del lipopolisaccaride (LPS). Nell’infezione naturale è stato osservato che l’antigene O è in grado di indurre una risposta immunitaria protettiva contro l’infezione da Shigella, ma tale risposta risulta essere specifica contro i singoli serotipi. Non ci sono al momento vaccini disponibili per prevenire l’infezione da Shigella. L’istituto “Novartis Vaccines Institute for Global Health” (NVGH) sta lavorando su un progetto per lo sviluppo di un vaccino proteico protettivo e ad ampio spettro per la prevenzione di infezioni da Shigella basato sull’utilizzo di particelle di membrana esterna. Queste particelle, chiamate Moduli Generalizzati per l’espressione di Antigeni di Membrana (GMMA) e comunemente conosciute in letteratura come vescicole di membrana esterna (OMV), sono naturalmente rilasciate dalla superficie dei batteri Gram-negativi e presentano all’ospite le proteine della membrana esterna nella loro conformazione originaria. Queste particelle si distinguono dalle OMV ottenute mediante estrazione con detergenti che sono prive di lipo-oligosaccaridi e lipoproteine. Poiché Shigella rilascia naturalmente piccole quantità di GMMA, è stata eseguita una delezione del gene tolR al fine di indurre un maggior rilascio di GMMA. Per abolire la risposta immunitaria serotipo-specifica dell’antigene O è stata eseguita una delezione del cluster di geni codificanti per l’antigene O. Una successiva delezione del gene msbB è stata effettuata per ridurre la reattogenicità delle molecole di LPS. Le GMMA sono state ottenute crescendo i ceppi produttori in condizioni limitanti di ferro al fine di indurre l’espressione di recettori del ferro molto conservati in Shigella. Tali recettori si sono dimostrati antigeni protettivi contro l’infezione da Salmonella. L’analisi delle GMMA di S. sonnei 53G e S. flexneri 2a 2457T attraverso approccio proteomico ha confermato che le GMMA contengono prevalentemente proteine di membrana esterna e proteine periplasmatiche. Nelle GMMA abbiamo identificato circa il 65% e il 71% delle proteine di membrana esterna predette in totale rispettivamente in S. flexneri e in S. sonnei e il 50% delle proteine periplasmatiche. Le proteine citoplasmatiche identificate nelle GMMA rappresentano, invece, solamente il 4% delle proteine citoplasmatiche totali predette. Abbiamo identificato 50 proteine di membrana esterna e 2 proteine con predizione extracellulare conservate nelle GMMA di S. sonnei e di S. flexneri. Tra le proteine comuni abbiamo identificato 3 proteine codificate dal plasmide di virulenza (MxiD, MxiM and IcsA/VirG) e altre 3 proteine con una funzione associata alla virulenza (SepA, SigA and TieB) che sono specifiche per Shigella e ceppi patogeni di E. coli. I risultati dell’analisi proteomica hanno inoltre confermato l’overespressione di 8 proteine ferro-regolate nelle GMMA, di cui 5 sono conservate in S. sonnei e S. flexneri. Le GMMA sono state utilizzate per l’immunizzazione di topi e i sieri immuni sono stati analizzati mediante saggi ELISA e Western blots bi-dimensionali (2-D WB). Tutte le GMMA testate hanno stimolato in modo equiparabile la produzione di alti livelli di immunoglobuline di tipo G (IgG) GMMA-specifiche. Dalle analisi di 2-D WB abbiamo identificato proteine immunogeniche prevalentemente periplasmatiche e solo 3 proteine di membrana esterna. Tali risultati hanno suggerito la necessità di trovare un approccio alternativo per l’identificazione di proteine di membrana esterna nella loro conformazione nativa. In questo studio presentiamo un approccio per l’identificazione di proteine immunogeniche di superficie basato su studi di immunoprecipitazione su batteri vivi usando sieri immuni specifici contro le GMMA. Abbiamo identificato 30 proteine immunogeniche di superificie e tra queste abbiamo trovato OmpA, OmpX e YaeT confermando i risultati precedentemente ottenuti mediante 2-D WB. Inoltre, abbiamo identificato proteine che sono riportate immunogeniche in Shigella, come ad esempio TolC, ma che non sono state rilevate mediante 2-D WB supportando l’efficacia di questo approccio. L’ulteriore identificazione delle proteine OmpC, FepA, FhuA e CirA mediante immunoprecipitazione suggerisce che la conformazione nativa degli epitopi è importante per il legame con l’anticorpo e che tali epitopi vengono persi nelle analisi di 2-D WB. Un’analisi proteomica di tipo quantitativa delle GMMA, basata sull’utilizzo di marcatura isotopica stabile con legame dimetilico seguita da GeLC-MS/MS, ha rivelato che la maggior parte delle 30 proteine immunogeniche sono anche le proteine più abbondanti nelle GMMA. E’ interessante notare che nonostante YiaD, YtfM e una delle proteine ferro-regolate (FepA) siano tra le proteine meno abbondanti nelle GMMA, tali proteine hanno indotto una forte risposta immunitaria. La maggior parte delle proteine immunogeniche identificate in S. sonnei sono anche presenti e altamente conservate nelle GMMA di S. flexneri. Perciò, è molto probabile che queste proteine siano in grado di indurre una risposta immunitaria cross-reattiva. Il presente studio mostra per la prima volta un’estensiva analisi proteomica di tipo qualitativa e quantitativa delle GMMA ottenute da Shigella. Inoltre, l’analisi delle proteine immunogeniche di superficie condotta in condizioni native ha permesso di identificare proteine altamente conservate tra i serotipi di Shigella. Questo lavoro fornisce le basi per una successiva caratterizzazione delle GMMA come vaccino a base proteica contro Shigella