Structural characterization of proteins involved in Helicobacter pylori motility and adhesion

Helicobacter pylori é un batterio Gram-negativo presente in piú del 50%della popolazione mondiale. Tuttavia, i ceppi piú aggressivi del batterio colpiscono solo il 10% delle persone affette, causando gastriti croniche e ulcera peptica. Tra queste, solo l’1% manifesta gravi patologie come MALT linfoma ed adenocarcinoma gastrico [1]. Il progetto descritto in questo lavoro di tesi é finalizzato alla determinazione strutturale ed alla caratterizzazione di proteine coinvolte nell’architettura del flagello di H. pylori. Difatti, la presenza del flagello é fondamentale per la colonizzazione da parte del batterio dell’intero ambiente gastrico. Il suo ruole é direttamente collegato all’abilitá del batterio di evitare la permanenza nell’ambiente gastrico, permettengli di attraversare lo strato di muco che aderire all’epitelio gastrico [2]. Grazie ad un set di adesine localizzate sia sulla membrana batterica, sia sui flagelli, H. pylori é in grado di aderire alle cellule epiteliali, cominciando il regolare processo di colonizzazione [3]. Inoltre, la presenza di un seti di 5-7 flagelli polarizzati (lunghi tra 2 e 5 μm) e la sua forma ad S garantiscono al batterio la propulsione e la velocitá necessaria per superare la barriera di muco e raggiungere l’epitelio [4]. In generale, la struttura del flagello é costituita da circa trenta diverse proteine, ma il numero puó crescere fino a cento considerando anche le proteine coinvolte nei meccanismi di chemotassia e di regolazione della crescita del flagello [5]. L’architettura generale del flagello é quella di una una complessa nanomacchina, caratterizzata dalla presenza di due principali componenti: i) la porzione dell’uncino e della parte basale, dove é collocato il motore della stuttura; ii) il filamento, che rappresento il vero propulsore della macchina [6]. Nel corso del progetto di dottorato, sono state analizzate le proteine che costituiscono la regione dell’uncino e ricoprono il filamento. La metodica utilizzata prevede l’amplificazione iniziale dei geni target utilizzando il DNA genomico dei ceppi G27 e P12 come templato. I geni amplificati sono stati inseriti in uno o due vettori di espressione, e le proteine ricombinanti sono state prodotte in colture di E. coli e purificate, tramite diversi metodi cro- matografici, dalla parte solubile della sospensione di lisi batterica. Le proteine dell’uncino di H. pylori non presentano un’elevata similaritá di sequenza con le altre proteine giá riportate in letteratura, pertanto la loro reattivitá in soluzione non é facilmente prevedibili a priori. FlgE, FlgE2, FlgK and HpaA (come proteina di rivestimento del flagello) sono le proteine del flagello analizzate durante questo lavoro di dottorato. Sebbene, tutte siano state clonate, espresse e purificate, solo FlgE2 ha fornito dei risultati sufficienti a condurre degli studi strutturali preliminari. I vari studi condotti sulle proteine del flagello sono riportati nel capitolo 3. FlgK é defina una hook-associated protein, che funge da giuntura tra il filamento e l’uncino [7], mentre FlgE é direttamente coinvolta nella polimerizzazione dell’uncino [8]. Entrambe le proteine sono state ampiamente caratterizzate in soluzione ma, sebbene siano stati preparati numerosi screen di cristallizzazione, nessuna delle due ha portato ad ottenere cristalli analizzabili tramite diffrazione a raggi-X. Il limite maggiore osservato nella produzione delle due proteine é l’eluizione di una grande quantitá di forma aggregata, durante il processo di purificazione via cromatografia ad esclusione dimensionale. Anche la proteina FlgE2 é coinvolta nel processo di polimerizzazione dell’uncino. Tuttavia questa sembra essere peculiare solo per le specie batteriche di Helicobacter e Campilobacter e, pertanto, non si hanno numerosi informazioni a riguardo. Durante il lavoro di tesi, la proteina é stata purificata sia in forma monomerica che in forma tetramerica e, in entrambi i casi, sono stati ottenuti cristalli analizzabili tramite diffrazione da raggi-X. Tuttavia, molti tentavi sono stati svolti per risolvera la struttura tramite molecular replacement, utilizzando come templato la struttura della proteina ortologa di Salmonella typhimurium, ma nessuno di questo ha avuto interamente successo. Tuttavia, é stato possibile descrivere un modello preliminario, che verrá successivamente discusso all’interno del capitolo. Poiché HpFlgE2 non presenta un’elevata similaritá con StFlgE2, é stata prodotta una variante in cui sono state sostituite le metionine con seleniometionine; in questo modo si é provato a migliorare calcolando le fasi relative agli atomi pesanti (Se) e successivamente espandendole tramite i dati raccolti per la proteina nativa. Quest’ultima parte del lavora é ancora in via di definizione. Inoltre, date le scarse conoscenze riportate in letteratura riguardanti la proteina, si é cercato di definirne la reale funzione a partire dall’interazione con lo specifico chaperone FlgD. La struttura cristallografica della proteina FlgD é stata risolta recentement [9], rivelando la presenza di un motivo lineare collocato nella parte C-terminale, rappresentativo di una zona di legame con la proteina coniugata. Il legame é stato confermato tramite termoforesi in microscala. Per potersi legare alle cellule epitaliali, H. pylori ha bisogno di un set di proteine (ade-sine) che ne permettano l’adesione. La proteina HpaA (Helicobater pylori adhesine A),analizzata nel capitolo 4, é una lipoproteina, localizzata sulla superfice del flagello ed inizialmente é stata ipotizzata affine all’acido sialico, esposto sulla superficie delle cellule gastriche [10]. Si suppone che la proteina possa operare come proteina di rivestimento delflagello e che faciliti il legame sulla superficie delle cellule attraverso l’adesione dei flagelli[11]. Inoltre, data la sua posizione esposta, HpaA é stata considerato un ipotetico target per lo svilluppo di vaccini [12]. Infine, la proteina da sola presenta un’elevata tendenza a creare degli aggreagati in soluzione, pertanto é stata espressa e purificata in fusione con una super-folder GFP [13]. La proteina é stata successivamente cristallizata ed é stata analizzata tramite diffrazioni da raggi-X. Sfortunatamente, l’analisi dei dati di diffrazione ha portato alla conclusione che i cristalli erano formati esclusivamente da sfGFP. Infine, nel capitolo 5 viene analizzata la proteina HP1457. Questa appartiene ad una classe di proteina recentemente riconusciute operare come outer-membrane proteine, coinvolte nella stimolazione della peptidoglicano-sintasi, PBP1B [14]. Inoltre, la proteina HP1457 appartiene ad un operone caratterizzato dalla presenza di geni che codificano per proteine di secrezione altamente immunogeniche. Tra queste: HP1454 [15], HP1455 (una lipoproteina di funzione ancora sconosciuta), HP1456 (identificata come la lipoproteina Lpp20) [16]. HP1457 é stata ampiamente caratterizzata in soluzione e sono stati effettuati numerosi tentativi di cristallizzazione su diversi costrutti, ma nessuno di questi ha portato ad ottenere cristalli.