Development and validation of methods for genome-wide epigenetic analyses of human myogenic cells

Negli ultimi anni l’epigenetica ha raccolto un sempre crescente interesse da parte della comunità scientifica, grazie al suo potenziale di spiegare i meccanismi di attivazione e repressione dell’espressione genica. In questa tesi si presentano i risultati di un progetto di analisi del ruolo dell’epigenetica nella miogenesi umana, mediante approcci genomici. Gli studi di epigenetica presentano tuttora ostacoli significativi, sia dal punto di vista sperimentale che di analisi computazionale del dato prodotto. Il mio primo obiettivo è stato quindi la messa a punto di un protocolli robusti per l’analisi del ruolo dei meccanismi epigenetici durante il differenziamento del muscolo scheletrico, in particolare la metilazione del DNA e le interazioni DNA-proteine (mediante il sequenziamento di DNA trattato con bisulfito e immunoprecipitazione della cromatina). In questa tesi, oltre alla descrizione dei protocolli sviluppati, sono riportati i primi risultati ottenuti applicando i suddetti protocolli alle cellule miogeniche. La metilazione è stata analizzata mediante trattamento con bisulfito del DNA, sequenziato successivamente con tecniche di nuova generazione (NGS). A tal riguardo è stato messo a punto un nuovo metodo per lo studio del metiloma intero, che è stato applicato ad un campione di mioblasti e successivamente sequenziato con la piattaforma SOLiD 5500xl. Questo approccio richiede tuttavia una quantità massiva di sequenze, che ad oggi risultano ancora eccessivamente costose. È stato quindi affiancato allo studio del metiloma il sequenziamento delle regioni più comunemente analizzate in studi di metilazione (ovvero regioni promotoriali ed isole CpG) con un kit di arricchimento di regioni target che cattura selettivamente più di 2.700.000 siti CpG nel genoma umano. Con questo approccio sono stati identificati meno di 600 siti differenzialmente metilati (DMS) nei mioblasti confrontati con i miotubi. Questo studio ha permesso di osservare che l’attivazione di geni muscolari sembra poco correlata con cambiamenti nella metilazione del DNA, permettendo di ipotizzare che la metilazione del DNA non abbia un ruolo centrale nel controllo dell’attivazione dei geni muscolo-specifici. L’analisi di questi dati ha inoltre permesso di rilevare che una significativa frazione di regioni differenzialmente metilate (DMR) localizza in prossimità di geni codificanti non-coding RNA. Da un lato quest’osservazione suggerisce che gli RNA regolatori potrebber avere un ruolo nell’epigenetica nel differenziamento muscolare, e inoltre che la metilazione del DNA potrebbe avere un ruolo nella regolazione di questi RNA. Un altro aspetto importante della regolazione epigenetica, oltre alla metilazione del DNA, è lo stato di condensazione della cromatina. Per vagliarne il contributo nell’ambito del differenziamento muscolare, è stato ottimizzato un approccio di immunoprecipitazione della cromatina seguito dal sequenziamento (ChIP-Seq) per definire la localizzazione nel DNA di specifiche modificazioni istoniche: H3K4me3, H3K27me3 and H3K9ac. I risultati di questi esperimenti di ChIP-Seq sono stati confrontati con quelli di analisi del profilo di espressione (RNA-Seq), permettendo di verificare un ampio margine di sovrapposizione fra il livello di espressione ed i risultati di ChIP-Seq. In particolare le modificazioni istoniche associate all’eucromatina localizzano nei pressi del sito di inizio di trascrizione di geni espressi, mentre i marker di eterocromatina fiancheggiano i promotori dei geni non attivi. Questa osservazione, assieme all’osservazione di DMR in nuovi RNA non codificanti, supporta l’ipotesi di un ruolo per nuovi circuiti regolatori di RNA nel differenziamento miogenic.