Design, Synthesis and Characterization of Polycyclic and Heteropolycyclic Compounds as Biologically Active Agents

L’attività di ricerca descritta in questa tesi di dottorato si inserisce all’interno di progetti avviati con diversi ricercatori presso Università sia italiane che estere e hanno come scopo principale l’identificazione, la sintesi e la validazione di nuove piccole molecole quali potenziali agenti farmacologici per il trattamento di diverse patologie: batteriche, antiparassitarie, tumorali e autoimmuni. I progetti presentano delle caratteristiche marcatamente multidisciplinari e questo ha permesso di estendere le mie esperienze ad ambiti non strettamente inerenti alla mia formazione curriculare e conseguentemente di acquisire consapevolezza della complessità della chimica farmaceutica nelle sue varie accezioni. La mia principale attività è consistita nella progettazione e sintesi chimica di composti organici a struttura policiclica ed etero-policiclica applicando metodi di sintesi classici ed avanzati. La diversità dei progetti mi ha indotto ad affrontare e approfondire lo studio di nuove procedure di sintesi organica fondamentali per l’ottenimento di una grande varietà di strutture chimiche proposte come potenziali farmaci. Accanto allo studio per la progettazione dei percorsi sintetici, questa tesi di dottorato è contraddistinta dalla grande mole di lavoro sperimentale in laboratorio come si evince dall’elevato numero di composti intermedi e finali ottenuti e che sono stati purificati e compiutamente caratterizzati da un punto di vista chimico-fisico. Pertanto, anche le mie competenze riguardo l’uso di strumentazioni presenti e non nel Dipartimento di Scienze del Farmaco si sono notevolmente consolidate, in particolare ho potuto approfondire le tecniche di indagine spettroscopica più diffuse ed essenziali nell’ambito della chimica farmaceutica come la spettroscopia NMR e la spettrometria di massa. La maggior parte dei composti da me preparati in laboratorio sono già stati studiati anche per la loro attività biologica allo scopo di valutarne il potenziale farmacologico e per questo sono molto grato ai ricercatori con cui ho proficuamente collaborato. Segue una breve descrizione dei risultati ottenuti nei vari capitoli. Capitolo 1. Diflunisal, un noto farmaco antiinfiammatorio della categoria dei salicilati, è stato recentemente riproposto come agente in grado di sensibilizzare lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente all’azione della meticillina. I principali problemi legati all’utilizzo di questo farmaco nella terapia antibiotica sono legati al meccanismo d’azione antiinfiammatorio, che può condurre a lesioni gastrointestinali anche gravi, e alla scarsa solubilità in acqua. Per queste ragioni abbiamo progettato e sintetizzato degli aza-analoghi del diflunisal, seguendo una via sintetica che prevede l’ottenimento di intermedi ossazolici e l’applicazione della reazione di Diels-Alder per generare così una libreria di analoghi acidi idrossi-piridin-carbossilici variamente sostituiti. A seguito della valutazione biologica i composti sintetizzati non presentano attività citotossica ed alcuni di loro presentano interessanti proprietà antinfiammatorie e soprattutto antibatteriche, sensibilizzando i batteri S. aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium e Pseudomonas aeruginosa all’azione di alcuni antibiotici. Capitolo 2. I 7-fenilpirrolochinolinoni (7-PPyQ) appartengono alla famiglia dei pirrolochinolinoni, una classe di composti che ha rivelato in anni recenti interessanti proprietà antitumorali. In particolare, alcuni derivati del 7-PPyQ agiscono come forti inibitori della polimerizzazione della tubulina e dimostrano grande affinità per il sito della colchicina. I dati ottenuti dallo studio di numerosi derivati hanno consentito la comprensione delle relazioni struttura-attività. Il problema principale di questi composti è dovuto alla scarsa stabilità metabolica in seguito ad ossidazioni multiple. Per questo motivo sono stati progettati e sintetizzati alcuni derivati inserendo l’atomo di fluoro in diverse posizioni allo scopo di esplorare l’influenza di questo elemento sull’attività biologica e sulla stabilità metabolica. La valutazione biologica comprende i test di citotossicità in vitro e antitumorale in vivo su modello murino di melanoma., saggi di inibizione della polimerizzazione della tubulina e ovviamente i test in vitro di stabilità metabolica. Capitolo 3. Il recettore nucleare RORγt, un’isoforma del recettore orfano correlato ai recettori dell’acido retinoico ROR, è stato identificato come principale responsabile dell’attività e dello sviluppo dei linfociti T-helper 17 (TH17), i quali sono implicati nella patogenesi di alcune malattie autoimmuni. Questo rende RORγt un bersaglio ideale per il trattamento di queste patologie. Esplorando la struttura dei ligandi steroidei naturali e sintetici di questo recettore e dei ligandi arotenoidi, è stata progettata una struttura ibrida come lead compound e generato una piccola libreria di analoghi, sfruttando in particolar modo le reazioni di Friedel-Crafts e di coupling di Suzuki. Saggi di citotossicità, attività estrogenica e modulazione dell’attività del recettore RORγt sono stati effettuati. I composti risultano essere meno potenti dell’acido ursolico, agonista inverso usato come riferimento, ma rappresentano un buon punto di partenza per lo sviluppo di nuovi agonisti inversi del recettore RORγt, a struttura steroidea. Capitolo 4. L’attività descritta in questo capitolo è stata possibile grazie ad un periodo di 6 mesi trascorso presso il laboratorio di modellistica molecolare del professor Andrea Brancale presso Cardiff University (UK). Il recettore trans-membrana Notch e il suo sistema di signalling sono fattori chiave nello sviluppo e mantenimento dell’omeostasi in molti tessuti. Un’attività irregolare di questo sistema rappresenta uno dei principali driver nella patogenesi e progressione di molte forme tumorali, in particolar modo leucemiche. L’attività di Notch è fortemente dipendente dal contesto, infatti presenta caratteristiche sia di oncogene che di oncosoppressore. La sua modulazione rappresenta quindi una possibilità terapeutica concreta. Ad oggi, non esistono molecole in clinica che agiscono direttamente sul recettore Notch, per questo motivo prendendo in esame due diversi binding sites, è stato effettuato uno studio di modellistica molecolare adiuvato da simulazioni di docking per identificare nuovi possibili ligandi. Sono stati realizzati diversi studi di virtual screening, sia con approccio structure-based che ligand-based, e 62 molecole provenienti da diversi database commerciali, sono state selezionate per la valutazione biologica. Dai risultati ottenuti è stato possibile identificare due hit compounds, i quali verranno sottoposti a ulteriore indagine in futuri studi di hit-to-lead optimization. Capitolo 5. La malattia di Chagas è una malattia tropicale negletta causata dal protozoo Tripanosoma cruzi. Attualmente, viene trattata mediante somministrazione di benznidazolo o nifurtimox, due vecchi agenti antiparassitari, che presentano molti effetti collaterali e limitata efficacia, soprattutto nella fase cronica dell’infezione. Un possibile bersaglio molecolare per il trattamento dell’infezione è rappresentato dall’enzima Tripanotione Reduttasi (TryR), responsabile della difesa del parassita contro lo stress ossidativo. L’inibizione di questo enzima incrementa la suscettibilità di T. cruzi nei confronti dei farmaci antiparassitari, probabilmente consentendo una riduzione del dosaggio e un maggiore successo della terapia. Uno structure-based virtual screening sulla struttura di TryR è stato effettuato confermando lo scaffold β-carbolinico come cruciale per la progettazione razionale di nuovi inibitori. La sintesi multi-step, comprendente reazione di Pictet-Spengler e coupling ammidico, è stata completata con successo per 7 derivati e al momento i composti sono sottoposti a valutazione biologica presso l’Universidad Metropolitana de Ciencias de la Educacion (UMCE), Santiago, Chile.