Immunogenicity during the treatment of chronic rheumatic diseases: focus on TH9 lymphocytes

Introduzione L’artrite reumatoide (AR) è una patologia cronica autoimmune con interessamento delle articolazioni diartrodiali. I meccanismi patogenetici alla base della malattia sono ancora poco chiari. Diverse cellule del sistema immunitario contribuiscono all’innesco e al mantenimento del processo infiammatorio. Tra di esse, i linfociti T helper (Th) svolgono un importante ruolo nella produzione di citochine, chemochine, nel reclutamento di cellule dal torrente circolatorio e nell’attivazione di cellule residenti. Tra i linfociti Th, le cellule Th9, che si sviluppano sotto l’azione combinata del Tissue Growth Factor-beta (TGF-β) e dell’interleuchina 4 (IL-4) a partite da cellule Th naive e Th2, sintetizzano IL-9 e, in minime quantità, IL-10, IL-17, IL-21 e IL-22, e sembrerebbero essere coinvolte nelle risposte immunitarie in corso di infestazioni parassitarie e allergie. Recentemente è stato dimostrato che queste cellule sono anche coinvolte nella patogenesi di patologie autoimmuni, come il lupus eritematoso sistemico, la sclerosi sistemica, l’artrite psoriasica e l’AR. In particolare, in corso di AR, i linfociti Th9 potrebbero dirigere la formazione dei centri linfoidi nel tessuto sinoviale e favorire la produzione di autoanticorpi come gli anticorpi anti-peptide ciclico citrullinato (ACPAs). Non è invece noto il ruolo di tali cellule nella risposta al trattamento con farmaci biologici e nei processi di immunogenicità. Scopo Obiettivo primario: valutare la prevalenza dei linfociti Th9 nel sangue periferico di pazienti con AR, in trattamento o meno con farmaci immunosoppressori (DMARDs convenzionali, steroidi o infliximab) e valutare l’immunogenicità di infliximab relativamente alle risposte Th9 dopo test di stimolazione in vitro, confrontando un gruppo di pazienti con AR responder a infliximab (Remicade®) con un gruppo di pazienti con AR non responder al farmaco. Obiettivo secondario: confrontare, con un test in vitro, l’immunogenicità Th9-correlata di infliximab originator Remicade® con quella del suo biosimilare (CT-P13, Remsima®). Valutare l’influenza delle variabili demografiche, cliniche e farmacologiche sulla variazione delle percentuali linfocitarie Th9. Metodi: Abbiamo arruolato 55 pazienti affetti da AR secondo i criteri ACR/EULAR 2010 e 10 controlli sani. I pazienti con AR erano suddivisi in un gruppo di 15 pazienti naive a terapie immunosoppressive, inclusi gli steroidi; un gruppo di 20 pazienti in trattamento con farmaci convenzionali, steroidi e infliximab (Remicade®) con buona risposta clinica e un gruppo di 20 pazienti che avevano fallito in passato la terapia con Remicade® per eventi avversi o inefficacia e che praticavano altre terapie biologiche (abatacept 10 mg/kg e.v. ogni 4 settimane in 13 casi; tocilizumab 8 mg/kg e.v. ogni 4 settimane in 5 casi; etanercept 50 mg a settimana s.c. in un caso e certolizumab pegol 200 mg ogni 2 settimane s.c. in un caso) oltre a DMARDs e steroidi. Era consentito l’uso di prednisone (< 10 mg/die), methotrexate (< 15 mg/settimana), sulfasalazina (< 3g/die), idrossiclorochina (< 400 mg/die). Dopo firma del consenso informato, le cellule mononucleate ottenute da sangue periferico (PBMCs) di ciascun soggetto sono state poste in coltura con aggiunta o meno di 50 μg/ml di infliximab originator (Remicade®) o 50 μg/ml di infliximab biosimilare (Remsima®), 50 μg/ml di IgG1kappa umane e 50 μg/ml di IgG Fc umane per 18 ore. La percentuale di linfociti Th9 cells è stata valutata per mezzo di indagini citofluorimetriche. I linfociti Th9 sono stati inizialmente identificati come cellule T CD4+ producenti IL-9 ma non esprimenti interferon-gamma (IFNγ), IL-4 e IL-17; e secondariamente come cellule T CD4+ PU.1+, IRF4+ e IL-9+. Sono state valutate inoltre le percentuali dei linfociti Th9 in accordo ai marcatori CCR7 e CD45RA al fine di distinguere le cellule naive dal pool delle cellule di memoria. Risultati Al basale, le percentuali di linfociti Th9, sia valutate in base al profilo citochinico che ai fattori trascrizionali, erano significativamente più alte nel gruppo di pazienti con AR rispetto ai controlli, e tra i pazienti, nel gruppo dei non trattati. Le percentuali di cellule Th9 non erano tuttavia significativamente correlate con lo sviluppo di eventi avversi o inefficacia, né con la comparsa di autoanticorpi non specifici per l’AR (es. anticorpi anti-nucleo). Dopo stimolazione con infliximab originator, la percentuale di linfociti Th9 PU.1+, IRF4+ ma non di quella dei linfociti IL-9+, IFNγ-, IL-4-, IL-17- aumentava significativamente rispetto al basale solo nel gruppo dei non responder. Questo evento non è stato registrato invece dopo stimolazione con infliximab biosimilare. Inoltre, quando i linfociti Th9 sono stati suddivisi in accordo all’espressione delle molecole CD45RA e CCR7, le cellule CCR7+ e CD45RA- (central memory) e quelle CCR7- e CD45RA- (effector memory) aumentavano significativamente rispetto al basale nel gruppo dei non responder dopo stimolazione con infliximab originator ma non biosimilare; al contrario nessuna variazione è stata registrata nelle percentuali dei linfociti CCR7+ e CD45RA+ (naive) nè in quella dei linfociti CCR7- e CD45+ (terminal effector memory). Conclusioni I nostri dati dimostrano che la percentuale di linfociti Th9, che rappresentano i maggiori produttori di IL-9, è maggiore nei pazienti con AR rispetto ai controlli sani. L’IL-9 potrebbe infatti giocare un ruolo fondamentale nel processo patogenetico della malattia. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che i linfociti Th9, valutati attraverso i fattori trascrizionali PU.1 e IRF4, potrebbero essere implicati nella risposta immunitaria contro gli epitopi di infliximab originator, attraverso fenomeni di recalling di cellule di memoria. Al contrario, nonostante diversi studi abbiano dimostrato una sostanziale comparabilità dal punto di vista biomolecolare e quindi del profilo di immunogenicità relativo alla produzione di anticorpi anti-farmaco tra infliximab originator e biosimilare, dopo stimolazione in vitro con Remsima® non abbiamo osservato variazioni nelle percentuali delle cellule Th9 rispetto al basale nel gruppo dei non responder. Il nostro lavoro si è incentrato su una diversa prospettiva immunologica nell’ambito dell’immunogenicità di un farmaco biologico anti-TNF, valutando anche la presunta sovrapponibilità del farmaco originator al suo biosimilare. Tuttavia, la conoscenza attuale sull’argomento è ancora scarsa e merita ulteriori ricerche.