The Photoexcited Triplet State as a Spin Probe for Distance Determination in Pulse EPR Dipolar Spectroscopy

Il ruolo di molte macromolecole di interesse biologico come ad esempio proteine ed acidi nucleici, dipende dalla loro struttura tridimensionale e da movimenti di domini dell’ordine di pochi nanometri. La spettroscopia paramagnetica elettronica (EPR) ed in particolare le tecniche di spettroscopia impulsata dipolare (PDS) costituiscono lo strumento ideale per studiare sistemi di quest’ordine di grandezza. Tuttavia, per poter utilizzare tecniche PDS nella caratterizzazione di bio-macromolecole, queste devono contenere centri paramagnetici come ad esempio ioni o cluster metallici, oppure centri radicalici. Nel caso in cui il sistema sia diamagnetico è necessario quindi inserire delle sonde paramagnetiche o sostituire eventuali metalli diamagnetici con altri metalli EPR-attivi. I radicali nitrossidi sono le sonde di spin più comunemente impiegate nella spettroscopia dipolare, soprattutto per studi in proteina in cui, per introdurre di tali sonde, è possibile seguire un protocollo di mutagenesi sito-specifica seguita da spin labeling diretto alle cisteine. L’inserimento di sonde di spin tuttavia può causare forti modifiche strutturali alla macromolecola o addirittura interferire con il suo corretto folding. Per questo motivo, quando possibile si tenta di sfruttare centri paramagnetici che siano naturalmente presenti in proteina. Sono stati infatti effettuati diversi studi di spettroscopia dipolare in metallo-proteine sfruttando la transizione ¢mS Æ §1/2 del gruppo prostetico contenente il centro metallico. L’utilizzo di tali gruppi prostetici non causa alcuna alterazione strutturale alla molecola, inoltre, diversamente da molte sonde endogene, questi sono strettamente ancorati all’intorno proteico e forniscono quindi informazioni strutturali più accurate. La porfirina in stato di tripletto fotoeccitato è stata di recente introdotta tra la collezione di sonde di spin utilizzabili nelle tecniche PDS. Nel loro stato fondamentale le porfirine sono diamagnetiche e pertanto EPR silenti, ma in seguito a fotoeccitazione laser possono popolare tramite inter-system crossing lo stato di tripletto eccitato a più bassa energia, divetando in tal modo EPR-attive. Il popolamento tramite inter-system crossing fa si che la popolazione dei sottolivelli di tripletto devii dalla distribuzione di Boltzmann, aumentando enormemente l’intensità del segnale EPR di tale specie che vengono per questo motivo definite "polarizzate". Inoltre derivati porfirinici sono presenti in numerosi sistemi naturali, come ad esempio le emoproteine o le proteine conivolte in processi fotosintetici, e ciò li rende particolarmente interessanti per l’utilizzo in spettroscopia dipolare in quanto possono essere sfruttati come sonde endogene. Il labeling ortogonale, basato sull’impiego di sonde di spin spettroscopicalmente distinte che possono essere eccitate selettivamente durante un esperimento EPR, rappresenta un approccio particolarmente vantaggioso nelle tecniche PDS. Gli stati di tripletto fotoeccitato hanno un valore aggiunto come sonde ortogonali perchè aggiungono alla selezione spettrale il fatto di essere sonde foto-indotte. Questa caratteristica fa si che sia possibile misurare distanze intarmolecolari tripletto-nitrossido, applicando la fotoeccitazione laser, e distanze ntermolecolari nitrossido-nitrossido spegnedo invece la fotoeccitazione. Mentre la fattibilità di esperimenti di spettroscopia dipolare applicati a stati di tripletto fotoeccitati era già stata dimostrata precedentemente a questo lavoro di tesi [Di Valentin, M.; Albertini, M.; Zurlo, E.; Gobbo, M. and Carbonera, D. J. Am. Chem. Soc., 2014, 136, 6582 -6585], mancavano completemente indagini in grado di stabilire l’affidabilità e l’accuratezza del nuovo sistema di labeling e un inquadramento teorico in grado di escrivere il comportamento di tali sistemi polarizzati ad alto spin durante l’esperimento PDS. Il lavoro alla base della presente tesi è consistito nella completa caratterizzazione spettroscopica e teorica di questi sistemi di spin. Per verificare l’affidabilità del nuovo approccio, le sonde di tripletto sono state testate con diverse tecniche PDS, e sono stati inoltre utilizzati vari cromofori per la foto-generazione del centro paramagnetico, effettuando l’analisi sia su sistemi modello che in proteina. Lo studio è stato completato con un esaustivo trattamento teorico dei sistemi tripletto-radicale in spettroscopia dipolare. La precisione e l’accuratezza del metodo sono state verificate misurando le tracce dipolari di un righello spettroscopico costituito da una serie di perptidi in ®-elica di lunghezza crescente, ognuno marcato con un cromoforo porfirinico e un radicale nitrossido. L’ottima correlazione trovata tra le distanze ottenute analizzando le tracce sperimentali e i dati strutturali derivanti dai calcoli ha permesso di dimostrare l’affidabilità delle sonde di tripletto nelle tecniche PDS. Attualmente sono disponibili diverse sequenze PDS che sfruttano diversi meccanismi per indurre l’oscillazione dipolare nelle tracce sperimentali. Molte di queste sequenze sono state quindi testate sulla sonda di tripletto in modo da verificarne le prestazioni con le diverse tecniche. La disponibilità di molteplici sequenze PDS e il loro buon funzionamento su sistemi fotoindotti permette di selezionare, a seconda dei casi, lo schema di impulsi che garantisce le migliori prestazioni in termini di rapporto segnale-rumore e ciò dimostra la versitilità delle sonde di tripletto. La nuova metodologia è stata estesa anche a studi in proteina utilizzando come sistemi modello la Peridinin-Chlorophyill a-Protein, appartenente alla classe delle proteine fotosintetiche, e neuroglobina umana, facente parte della famiglia dellle globine. In Peridinin-Chlorophyill a-Protein è stata misurata l’interazione dipolare tra uno dei carotenoidi presenti nel sito attivo e un nitrossido inserito tramite spin labeling, permettendo non solo l’individuazione del pigmento coinvolto nel meccanismo di fotoprotezione, ma espendendo anche l’applicabilità dell’esperimento a cromofori diversi dai derivati porfirinici. Nella neuroglobina umana invece la zinco-sostituzione dell’eme ha permesso di popolare lo stato di tripletto nel gruppo endogeno e dimostrando che la tecnica dipolare fotoindotta può essere utilizzata anche nello studio strutturale di proteine (macromolecole) apparteneneti alla classe delle emoproteine. Infine è stata effettuata anche un’esaustiva caratterizzazione teorica delle sonde di tripletto basata sul formalismo della matrice densità. E’ stata ricavata l’espressione che descrive la modulazione delle tracce dipolari in sistemi tripletto-radicale, che è risultata essere analoga a quella ottenuta per sistemi di due radicali interagenti. Successivamente è stato implementato un programma per il calcolo numerico di tracce dipolari che ha permesso una descrizione quantitativa diversi sistemi tripletto-radicale.