The entry of tetanus and botulinum neurotoxins into neurons

Le Neurotossine clostridiali (CNT), sono esotossine di origine batterica che causano le due note sindromi neuroparalitiche tetano e botulismo attraverso il blocco della neuroesocitosi. Sono composte da due catene principali legate covalentemente da un unico ponte disolfuro. La catena pesante di 100 kDa (H) fornisce il legame neurospecifico e media l'ingresso della catena leggera (L) di 50 kDa nei neuroni bersaglio. Dopo il legame sulla membrana plasmatica, queste neurotossine entrano nei terminali nervosi all'interno di vescicole sinaptiche tramite endocitosi. Qui il pH acido induce un cambiamento strutturale della molecola che diventa capace di traslocare la catena L nel citosol, grazie ad un canale predisposto dalla catena H. Questo è il passaggio meno conosciuto lungo tutto il processo perlopiù a causa della sede dove avviene, ovvero piccoli compartimenti endocitici scarsamente manipolabili dall’esterno. Nel presente studio si descrive come questo passaggio sia stato reso accessibile all'indagine facendolo verificare sulla superficie dei neuroni. La neurotossina, legata a freddo alla membrana plasmatica di neuroni primari di cervelletto, è stata esposta ad un mezzo tamponato a basso pH per simulare quanto avviene nelle vescicole sinaptiche. L'ingresso della catena L è stato monitorato misurando l'attività metalloproteasica specifica con un metodo raziometrico. Abbiamo trovato che la neurotossina deve essere necessariamente legata alla membrana con almeno due siti di ancoraggio al fine di andare incontro ad un cambiamento strutturale funzionale alla traslocazione. Inoltre, questo processo può avvenire solo se il disolfuro intercatena è intatto. La pH-dipendenza del riarrangiamento conformazionale della tossina tetanica (TeNT) e delle tossine botuliniche (BoNT) B, C e D è simile e avviene nello stesso intervallo, in una condizione di media acidità, tuttosommato simile a quella che si pensa esistere all'interno vescicole sinaptiche. Grazie a questo affidabile metodo di indagine, abbiamo proceduto studiando la dipendenza dalla temperatura e la cinetica della traslocazione di TeNT, BoNT/C e BoNT/D. A 37 °C, la traslocazione delle tre diverse tossine varia nel tempo, ma rimane sostanzialmente nell'intervallo di minuti minuti, mentre ne richiede molto più a 20 °C. BoNT/C non trasloca a 20 °C. La traslocazione, come precedentemente visto, dipende anche dalla dimensione del gradiente di pH. Questi dati vengono discussi considerando l’intero arco di tempo necessario alla tossine per intossicare i neuroni, così come la scarsa tossicità delle tossine nei vertebrati a sangue freddo. Un altro evento fondamentale lungo il processo di intossicazione è la riduzione del legame disolfuro intercatena. Questa è una conditio sine qua non per liberare la parte catalitica della molecola nel citosol dei neuroni. Utilizzando inibitori specifici dei diversi sistemi ossidoreduttivi citoplasmatici, si è dimostrato che il sistema NADPH-tioredossina reduttasi-tioredossina, è il principale responsabile di questo evento. Inoltre, auranofin viene indicato come possibile molecola lead per la progettazione di nuovi inibitori di queste neurotossine. BoNT/A è responsabile della maggior parte dei casi di botulismo nell’uomo e allo stesso tempo è indicata, quasi senza alternative, come agente terapeutico per il trattamento di numerose condizione patologiche. Alcune prove indicano che essa penetra all’interno dei terminali nervosi via endocitosi di vescicole sinaptiche, ma questo non è mai stato formalmente provato. La subunità catalitica accede quindi al citosol grazie ad un cambiamento conformazionale guidato da un gradient di pH. Tuttavia, quale sia il compartimento acido sfruttato dalla tossina per innescare il cambiamento conformazionale non è stato ancora determinato. Attraverso esperimenti di immuno detezione e miscroscopia elettronica, abbiamo dimostrato che BoNT/A sfrutta il riciclo di vescicole sinaptiche per essere internalizzata e che il numero massimo di tossine per vescicola è dettato dal numero di recettori proteici, nella fattispecie SV2, presenti all’interno della stessa, piuttosto che dal recettore glicolipidico presente sulla membrane esterna. A suffragio di ciò, la rapida inibizione dell’acidificazione dei compartimenti acidi attraverso specifici inibitori, mostra una cinetica di traslocazione di BoNT/A talmente rapida da poter escludere con certezza che tale evento possa avvenire a livello di organelli acidificabili diversi dalle vescicole sinaptiche, quali possono essere ad esempio gli endosomi. Presi nel loro insieme, questi risultati propendono per un funzionamento di BoNT/A come una nanomacchina capace di traslocare la subunità catalitica attraverso l’impiego di una o tuttalpiù due molecole. Un altro aspetto per cui la ricerca sulle CNT è importante è sicuramente il loro impiego in terapia umana. BoNT/A è usata nel trattamento di molte malattie umane caratterizzate da iperattività dei terminali nervosi periferici colinergici. Purtroppo, alcuni pazienti sono o diventano resistenti alla terapia. Questo inconveniente può essere superato utilizzando altre tossine botuliniche ed infatti studi pre-clinici sono stati condotti con differenti sierotipi di tossina. La neurotossina botulinica di tipo D non è mai stato testata in vivo su muscoli umani. Qui viene mostrato che BoNT/D rappresenta la tossina più efficace in preparazioni in vivo ed ex vivo nei topi. Da questi esperimenti preliminari, sono state determinate le dosi da testare in volontari umani. L'effetto della iniezione nel muscolo delle dita umano Extensor Digitorum Brevis è stata saggiata misurando la risposta del potenziale d’azione evocato nei muscoli a diversi tempi dopo l'iniezione. BoNT/D è risultata essere scarsamente efficace nella neuroparalisi del muscolo scheletrico umano ed è per cui poco appetibile per l’uso umano. Questi risultati sono stati interpretati considerando i recenti risultati in merito ai recettori sfruttati da tale sierotipo e il modo con cui la stessa si lega ad essi.