Involvement and contribution to virulence of Endo-Beta-1,4-Xilanases of Fusarium Graminearum during host infection

Fusarium graminearum è un fungo filamentoso conosciuto come principale agente della fusariosi della spiga (FHB), una importante malattia che colpisce principalmente cereali da granella. Nel frumento il patogeno attacca la spiga in fase di fioritura, causando considerevoli perdite di raccolto e riducendo la qualità delle cariossidi a causa della contaminazione da micotossine tricoteceni, prodotte dal fungo durante il processo infettivo. Diversi studi citologici hanno dimostrato una correlazione tra l' infezione della spiga e la produzione da parte di F. graminearum di enzimi degradativi della parete cellulare vegetale. I tessuti del frumento, come quelli di altre piante monocotiledoni commelinoidi, sono particolarmente ricchi in xilano, il quale può essere idrolizzato dalle endo-β-1,4-xilanasi fungine. FGSG_03624 è uno dei geni codificanti endo-xilanasi più espressi da F. graminearum in spiga di frumento al terzo giorno di infezione, ed è stato espresso eterologamente nel lievito Pichia pastoris. La proteina ricombinante ottenuta (22.7 kDa) possedeva attività xilanasica e induceva morte cellulare e accumulo di perossido di idrogeno in tessuti di frumento quali foglie infiltrate con 10 ng/μl o glume trattate con 20 ng/μl. Questo effetto riflette quanto osservato per altre xilanasi fungine di Trichoderma reesei, T. viride and Botrytis cinerea, con cui FGSG_03624 condivide uno stretch di aminoacidi riportato in letteratura come essenziale per l'Â elicitazione della risposta necrotica. Sono stati ottenuti diversi mutanti con il gene FGSG_03624 deleto, i quali mostravano circa il 40% di riduzione dell'attività xilanasica totale rispetto al ceppo wild type se cresciuti in una coltura contenente xilano come unica fonte di carbonio. Anche se la xilanasi FGSG_03624 è in grado di indurre sintomi simili a quelli osservati nella risposta ipersensibile in tessuti di monocotiledone, i mutanti ottenuti dalla delezione del gene corrispondente sembravano possedere completa virulenza quando inoculati in spighe di frumento tenero delle cultivar Nandu e Bobwhite, probabilmente a causa della ridondanza dei geni codificanti xilanasi. Il ruolo della xilanasi FGSG_03624 durante l'Â infezione del frumento rimane quindi elusivo. Per ottenere informazioni circa l' importanza dell' attività xilanasica prodotta da F. graminearum durante l' infezione della pianta ospite, il fattore trascrizionale Xyr1, che regola putativamente l' espressione di diversi geni codificanti per enzimi xilanolitici, è stato deleto tramite ricombinazione omologa sito-specifica. I mutanti derivati dalla delezione del gene FGSG_17662, codificante Xyr1, sono stati cresciuti in coltura liquida con xilano come unica fonte di carbonio e hanno mostrato una ridotta capacità di produrre biomassa ed una consistente diminuzione dell' attività xilanasica totale rilevata nel mezzo di coltura: in particolare, l' attività xilanasica prodotta dai mutanti era solo il 10% dell' attività è secreta dal ceppo WT, e il peso secco dei mutanti risultava ridotto del 40-70%. I mutanti di F. graminearum con gene xyr1 inattivato sono ora disponibili per l' analisi trascrizionale in vivo, che consentirà di studiare la regolazione mediata da Xyr1 dell' espressione di geni codificanti enzimi xilanolitici durante l' infezione della pianta ospite. I mutanti saranno inoltre caratterizzati per la loro virulenza mediante inoculo di spighe di Triticum aestivum. Se la virulenza di questi mutanti sarà dimostrata essere compromessa dalla delezione di xyr1, la sovrespressione di inibitori delle xilanasi in pianta potrà essere considerata come strumento per il controllo della fusariosi della spiga