Identification of molecular biomarkers to discriminate and characterize the different types of rejection in Heart Transplated Patients

Contesto: Il trapianto di cuore è l'unico trattamento curativo disponibile per i pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Durante il primo anno dopo il trapianto più del 25% dei pazienti può subire episodi di rigetto e affrontare il rischio di sviluppare rigetto con conseguente disfunzione dell’ organo trapiantato con un aumento della morbilità e mortalità. Prevenire e trattare il rigetto acuto è l’ obiettivo principale per i medici che lavorano con pazienti trapiantati. Le linee guida ISHLT 2005 e 2013 hanno definito il profilo istopatologico di tre tipi di rigetto: Cellulare (ACR) Humoral (AMR) e Mixed (MIX). Al giorno d'oggi le biopsie endomiocardiche seriali (EMB) a intervalli decrescenti durante il primo anno dopo il trapianto e gli esami di laboratorio, come le misurazioni di anticorpi donatore specifici (DSA), rimangono parametri di riferimento nella diagnosi e nel monitoraggio del rigetto acuto, ma sono soggetti a artefatti dovuti alle metodologie di campionamento, interpretazione e test. Pertanto questa valutazione istopatologica necessita di nuovi biomarcatori integrativi per caratterizzare la stratificazione del rischio nel rigetto da trapianto di cuore. Ad oggi, i meccanismi esatti coinvolti nel rigetto dopo il trapianto non sono completamente compresi, quindi la ricerca sui processi che governano i meccanismi di rigetto e la scoperta di biomarcatori efficaci per diagnosticare, monitorare e prevedere il rigetto sarà di grande valore per lo sviluppo e miglioramento delle terapie contro il rigetto. L'avvento della tecnologia di sequenziamento come Next Generation Sequencing (NGS) sta cambiando la genomica medica accelerando la scoperta di nuovi biomarcatori di malattie. I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA non codificanti (19-24 nucleotidi), altamente conservate, che regolano l'espressione dei geni a livello post-trascrizionale. Obiettivo: Lo scopo di questo studio è identificare il profilo di espressione di MicroRNA (miRNA) nel primo anno dopo il trapianto di cuore (HTX) con la tecnologia Next Generation Sequencing (NGS) in biopsie endomiocardiche (EMB) fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE), per caratterizzare i tre diversi tipi di rigetto da trapianto di cuore classificati come Cellulare, Umorale e Misto. Metodi: due gruppi di pazienti (pz.) sono stati inclusi: un gruppo di studio di 19 pz. e un gruppo di validazione di 14. Per ogni paziente abbiamo selezionato la prima biopsia endomiocardica (EMB) fissata in formalina ed inclusa in paraffina (EMB) per ogni tipo di rigetto. Abbiamo escluso i pz. presensibilizzati con precedente impianto del dispositivo di assistenza ventricolare sinistro (LVAD) e con precedenti episodi di infezione. Le biopsie sono state esaminate per la presenza di rigetto secondo i criteri di classificazione internazionali aggiornati (ISHLT 2005 e 2013). Abbiamo quindi individuato quattro gruppi: Acute Cellular Rejection (ACR) con ACR a 12 punti:> = 2R, pAMR: 0, DSA: Neg; Misto con 6 pts ACR:> = 2R, pAMR> 1 (i +), DSA: Pos; Reiezione mediata da anticorpi (AMR) con 5 punti ACR: 0, pAMR> 1 (i +), DSA: Pos; Controllo con 10 punti: ACR: 0, pAMR: 0, DSA: Neg. La piccola frazione di RNA della coorte di studio è stata sequenziata con NGS Ion Proton per definire l'espressione dei miRNA maturi. Abbiamo eseguito un'analisi successiva con edgeR confrontando a coppie i gruppi per identificare i miRNA espressi differenzialmente nei diversi rigetti. Abbiamo selezionato 13 microRNA secondo l'analisi bionformatica come possibili biomarcatori i quali sono stati confermati da qRT-PCR in tutti i pz. Con l'analisi di regressione logistica multivariata abbiamo identificato gruppi univoci di miRNA come modelli predittivi specifici per ciascun rigetto. Inoltre, la PCR in situ è stata eseguita sulle stesse EMBs per rilevare l'espressione e la localizzazione dei miRNA nei tipi di cellule all'interno delle EMBs. Risultati: l'identificazione del miglior metodo di estrazione di microRNA da EMBs FFPE è stato il primo risultato che ho raggiunto. Ho testato diversi metodi sia manuali che kit commerciali e ho modificato i protocolli per ottenere una buona qualità e una quantità adeguata di microRNA per l'applicazioni successive. Con NGS abbiamo ottenuto e analizzato oltre 2257 microRNA maturi in tutte le biopsie del gruppo di studio. I tre tipi di gruppi di controllo e di rigetto sono stati confrontati in coppia con l'analisi non supervisionata che mostra per ciascun gruppo un profilo tipico di miRNA differenzialmente espressi; in particolare: Misto vs AMR: solo 2 miRNA sovraespressi nel gruppo Misto suggeriscono una somiglianza tra i due tipi di rigetto. ACR vs AMR: 18 miRNA sovraespressi e 2 miRNA sottoespressi nell'ACR. Mixed vs ACR: 7 miRNAs non sovraespressi e 39 miRNA sovraespressi nel gruppo ACR. L'analisi ha rivelato che ci sono microRNA de-regolati tra i tre tipi di rigetto confermando la nostra ipotesi che i microRNA possano caratterizzare le tre condizioni patologiche. I MiRNA sono stati selezionati per un'ulteriore valutazione e convalida, in base al numero di reads risultanti da NGS, sulla loro FDR significativa (<0,05), fold change, p-value e il loro coinvolgimento in processi rilevanti correlati al rigetto come mostrato dalle analisi bioinformatiche basate su geni target validati e riportati in database pubblici come TarBase (versione 6.0) (111), miRTarBase (112), miRWalk (113), miRecords (114), DIANA-microT-CDS (115), miRmap (116) , miRDB (117), TargetScan (118) e miRanda (119). Alla fine abbiamo selezionato 13 microRNA. Per validare i dati NGS tramite qRT-PCR abbiamo arruolato altri EMBs da 14 pz. selezionati in base ai nostri criteri e abbiamo testato su tutte le 33 EMbs, sia quelle della coorte di studio che quelle della coorte di validazione, i microRNA selezionati. L'analisi di validazione ha mostrato un pattern di espressione simile per tutti i microRNA in particolare: 6 hsa-miRNA: 29c-3p / -29b-3p / 199a-3p / 190a-5p / 27b-3p / 302b-3p possono differenziare tutti i rigetti rispetto a controlli; 3 hsa-miRNA: 31-5p / 144-3p / 218-5p sono peculiari di AMR e MIX rispetto al controllo e ACR 2 hsa-miRNA: 451a / 208a-5p identificano MIX rispetto ai controlli. Usando l'espressione di miRNA e la condizione patologica come variabili dipendenti abbiamo creato modelli di regressione logistica: MIX: (miR-208a, 126-5p, 135a-5p); ACR: (miR-27b-3p, 29b-3p, 199a-3p, 208a, 302b-3p); AMR: (miR-208a, 29b-3p, 135a-5p, 144-3p) che identificano con alta specificità e sensibilità ciascun tipo di rigetto. Infine con PCR in situ abbiamo rilevato alcuni di questi microRNA in diversi tipi di cellule: miR-29b-3p era principalmente espresso nelle cellule muscolari lisce in ACR; miR-144-3p era espresso nei macrofagi e nelle cellule endoteliali; inoltre l'espressione di questo microRNA nei macrofagi era predominante e diffusa nell'ACR rispetto all'AMR. Il miR-126-5p è risultato espresso in campioni ACR e AMR non solo nelle cellule endoteliali ma anche nei cardiomiociti e nelle cellule muscolari lisce. Per il MicroRNA 451a abbiamo trovato una co-localizzazione del segnale nelle cellule endoteliali e nei linfociti. Conclusioni: Questo studio dimostra che i microRNA possono essere ottenuti facilmente dai tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina, i miRNA differenzialmente espressi sono coinvolti in meccanismi patofisiologici del rigetto quali regolazione e proliferazione del ciclo cellulare del sistema immunitario, vie infiammatorie mediate da NFkB e rimodellamento endoteliale. Secondo i nostri risultati, i miRNA sovra o sotto espressi hanno mostrato una modulazione di questi processi in un modo peculiare per ciascun tipo di rigetto. I modelli di regressione logistica identificati potrebbero rappresentare un potente strumento diagnostico e il rilevamento in situ dei miRNA getta nuova luce sui meccanismi patofisiologici del rigetto. Inoltre l'espressione di MiRNA 144-3p, 126-5p, 29b-3p e 451a identificati mediante PCR in situ in cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e infiammatorie è diagnostica e costituisce un potenziale bersaglio farmacologico contro il rigetto da trapianto di cuore.