Genomic and bioinformatic approach to avian influenza virus evolution

I virus zoonotici, cioè in grado di infettare l’uomo e alcune specie animali, hanno un impatto significativo e costituiscono una costante, potenziale minaccia sia per la salute pubblica umana che per quella animale. Ecosistemi dagli equilibri modificati, una crescente urbanizzazione e connessioni facilitate hanno influenzato sempre piu' il rapporto tra patogeni e specie ospiti affini. Negli ultimi anni la fonte della maggior parte dei virus potenzialmente pericolosi e in grado di causare malattie emergenti sembra derivi da ospiti di origine animale; si tratta prevalentemente di virus a RNA che, grazie alla possibilità di moltiplicarsi in breve tempo all'interno di una popolazione ampia ed all'alto tasso di mutazione, permettono una rapida evoluzione, un'elevata variabilità genetica e la selezione di nuove varianti. Un adeguato e costante programma di sorveglianza, la condivisione di conoscenze e una collaborazione tra diverse competenze professionali sono fondamentali e necessarie per seguire l'evoluzione virale e per formulare politiche di sanità pubblica efficienti (Howard e Fletcher, 2012). L' Influenza virus di tipo A è considerato uno dei virus a RNA più importanti, tanto per il suo potenziale ruolo zoonotico nell'interfaccia animale-umano, quanto per la salute globale e l'impatto economico. Quasi ogni anno epidemie di influenza provocano morbilità e mortalità nell'uomo e talvolta gli stessi virus possono essere associati a pandemie. Il serbatoio naturale dei virus influenzali di tipo A è rappresentato dagli uccelli, sia selvatici che domestici (influenza aviaria) (http://www.cdc.gov/flu/about/viruses/transmission.htm); in particolare gli uccelli selvatici sembrano costituire la fonte dell'influenza A virus tutte le altre specie animali. Diverse tecniche sono disponibili per studiare i virus e caratterizzarli geneticamente al fine di capirne il loro comportamento, le dinamiche evolutive, il loro rapporto con l'ospite e la loro origine e per sviluppare profilassi e terapie adeguate creando un valido supporto durante la fasi di sorveglianza e diagnosi di un'eventuale epidemia . Nell'ambito del mio dottorato è stato utilizzato un approccio integrato, sia genomico che strutturale, per studiare l'evoluzione dell'influenza aviaria; particolare interesse è stato rivolto allo studio dell'emoagglutinina virale, la principale glicoproteina di superficie, appartenente ai sottotipi H5, H7 e H9 (i principali sottotipi “aviari” responsabili di infezione nell’uomo). Le analisi mediante Next Generation Sequencing (NGS) hanno favorito lo studio e la caratterizzazione della complessità nella popolazione virale, consentendo di monitorare finemente l'evoluzione delle varianti geneticamente correlate presenti all'interno della popolazione virale tramite l'identificazione delle mutazioni a bassa frequenza. Per confrontare ed analizzare i dati genetici, l'approccio filogenetico si è rivelato un utile strumento per l'analisi dell'evoluzione virale; è stato usato per spiegare l'epidemiologia molecolare, la trasmissione e l'evoluzione virale. Al fine di ottenere una visione più completa in termini di 'evoluzione funzionale', l'analisi filogenetica è stata integrata con le informazioni provenienti dal confronto strutturale. L'approccio strutturale, considerando lo spazio tridimensionale dell’emoagglutinina, ha dimostrato di poter essere uno strumento utile per evidenziare eventuali somiglianze e per ispezionare e valutare quei motivi il cui ruolo non può essere correttamente interpretato utilizzando le sole sequenze primarie. Infatti, nelle sequenze primarie il peso delle mutazioni non tiene conto dell'effetto sul fold o sulle proprietà di superficie, mentre nelle strutture tridimensionali, quanto ciascuna mutazione sia in grado di influenzare le caratteristiche strutturali e le interazioni, è direttamente rilevabile. Questo approccio ha inoltre portato un ulteriore contributo all'analisi filogenetica. In particolare lo studio si è concentrato sull'analisi delle dinamiche evolutive e delle strategie adattative dei sottotipi H7N1 ed H7N3 dell'influenza aviaria circolanti nel Nord Italia per periodi di tempo analoghi e in condizioni epidemiologiche simili. Inoltre è stato utilizzato il deep sequencing per studiare le dinamiche evolutive e di trasmissione intra- e inter-ospiti del virus aviario sottotipo H7N7 che colpì alcuni allevamenti italiani nel 2013. L'analisi NGS è stata utilizzata per caratterizzare la complessità della popolazione virale in due gruppi di animali sperimentalmente infetti con lo stesso virus ad alta patogenicità (HPAI) H5N1 ed immunizzati con distinti vaccini. E' stato inoltre eseguito un ampio confronto strutturale su domini e sub-regioni dell'emoagglutinina di diversi sottotipi del virus dell'influenza, con particolare interesse per i diversi clades di HPAI H5N1 circolanti in Egitto (ove l’influenza aviaria è endemica nei volatili), per indagare eventuali variazioni dominio-specifiche. I virus influenzali del sottotipo H9 sono stati analizzati da un punto di vista sia filogenetico che strutturale, per rilevare caratteristiche tipo specifiche e verificare se la variazione delle proprietà di superficie possa essere un marcatore di 'evoluzione funzionale' dei determinanti di superficie virali, come dimostrato nel sottotipo H5N1. Questo lavoro suggerisce che il confronto e l'integrazione tra analisi genomica, filogenetica e strutturale può aiutare a capire l' 'evoluzione funzionale' del virus dell'influenza aviaria di tipo A.