LAB on CHIP: capacitive stimulation of cells

Scopo principale del progetto di Dottorato "LAB on CHIP" finanziato dalla Fondazione Cariparo è stato lo sviluppo di un dispositivo che agevoli la creazione di cloni di cellule CHO per la produzione di proteine a scopo terapeutico. In particolare il fine ultimo è quello di ridurne tempi e costi associati alla produzione. Le cellule di mammifero in coltura sono ormai il sistema più diffuso per la produzione di proteine per applicazioni cliniche. La qualità e l'efficacia di una proteina possono essere superiore se essa è espressa in cellule di mammifero rispetto ad altri organismi, quali batteri, piante e lieviti. Ad oggi più del 60 % di tutte le proteine ricombinanti per applicazioni farmaceutiche è prodotto in cellule di mammifero. Vettori di espressione per la creazione di linee cellulari stabili da DNA ricombinante utilizzano vettori virali per indurre l'espressione del gene. Ma la transfezione senza l'ausilio di virus rimane l' approccio prediletto per la generazione di linee stabili per questi scopi. La transfezione è un processo complesso e, affinchè avvenga con successo, tutti i sottoprocessi coinvolti devono svolgersi efficientemente. Il dispositivo proposto si basa sul fenomeno fisico chiamato elettroporazione, che non è altro che la formazione di pori temporanei nella membrana plasmatica a seguito dell'applicazione di opportuni campi elettrici. I comuni approcci utilizzati per migliorare la transfezione tramite elettroporazione richiedono tempi lunghi e possono essere inefficaci. E' importante poter sviluppare metodi nuovi che permettano un controllo di tutti i parametri critici coinvolti in modo da poterne identificare le cause in caso di fallimento e dunque migliorare l'efficienza. L'elettroporazione su chip utilizzzando correnti capacitive può essere un valido approccio. Per poter rilevare la formazione di pori, sono stati fatti esperimenti di patch-clamp su chip durante l'elettroporazione. In tal modo sono stati selezionati i protocolli più promettenti. Per quanto riguarda lo sviluppo del dispositivo, ne è stata verificata la biocompatibilità. Si è valutato lo stato delle colture cellulari che hanno mostrato normali sviluppo, adesione e tempo di replicazione. Non sono state rilevate reazioni chimiche tra il mezzo di coltura e il diossido di titanio. Non si sono inoltre rilevati problemi di corrosione o danneggiamento dell'ossido a causa di prodotti metabolici della cellula. Gli esperimenti di patch-clamp hanno permesso di selezionare un protocollo che è stato poi testato sulle cellule in coltura. Il prototipo sviluppato ha dimostrato l'elettroporazione di cellule CHO in coltura, ottenendo un'efficienza media del 30 %. E' stata inoltre dimostrata la selettività di tale dispositivo e la sua applicabilità sia per la transfezione che per l'introduzione nella cellula di marcatori. Risultati "collaterali" ottenuti riguardano la dimostrazione della formazione di pori temporanei sia sulla membrana adesa che su quella libera e la possibilità di studiare la dinamica dei pori