Estrazione di cellule staminali da cordone ombelicale e loro differenziamento in colangiociti

Le malattie colestatiche croniche congenite o acquisite (cirrosi biliare primitiva, colangite sclerosante, atresia pediatrica delle vie biliari) rappresentano nel loro insieme una delle principali indicazioni al trapianto di fegato. Nell’ultimo ventennio, nuove ed innovative strategie terapeutiche basate sull’impiego di cellule staminali adulte, ovvero cellule staminali multipotenti identificate in tessuti diversi dell’organismo in età postnatale, sono state caratterizzate e proposte in chirurgia epatica. Tale ricerca si inserisce in un programma di studio che in campo epatologico mira all’identificazione di popolazioni cellulari staminali adulte (CCO), che, isolate da una fonte di facile accesso ed eticamente approvata quale la gelatina di Wharton., possono rappresentare candidati ideali per la terapia cellulare delle colangiopatie. In tale prospettiva, le popolazioni cellulari CCO sono state stimolate in vitro con fattori induttivi per testare la loro capacità di differenziare in cellule simil colangiociti. All’analisi di citofluorimetria, le popolazioni fibroblastoidi ottenute hanno mostrato positività all’espressione di marcatori di staminalità quali CD105, CD90, CD133 e negatività alla presenza di CD45, cKit, CD44 e HLA-DR. Sebbene l’immunofenotipo si sia mantenuto stabile nel corso delle subcolture, è stato osservato, dopo 15 passaggi, un significativo aumento percentuale di cellule positive per i marcatori CD133, CD44 e cKit. Similmente alle popolazioni cellulari staminali definite “migranti”, le popolazioni CCO presentano mRNA specifici per le metalloproteinasi di matrice quali MMP2 e MMP3 e rispondono agli stimoli differenziativi in senso adipogenico, osteogenico e condrogenico fino alla subcoltura XV, come dimostrato dai tipici accumuli lipidici citoplasmatici e dall’espressione di specifici marcatori quali il perlecano, Runx-2, osteocalcina ed osteopontina. Per valutare il grado di potenzialità differenziativa colangiocitaria sono stati allestiti a) un sistema di coltura bidimensionale per semina su piastre di polistirene non condizionate, b) un sistema di coltura tridimensionale per lo studio della tubulogenesi in vitro mediante incapsulazione delle cellule in una matrice di collagene 1 e Matrigel (MATCO), c) un sistema di coltura su coating di matrice MATCO. Dopo 7 giorni di stimolazione, le cellule coltivate nel sistema bidimensionale hanno dimostrato, all’analisi di immunofluorescenza e di citofluorimetria, l’espressione di marcatori tipici di linea colangiocitaria quali CK19 e GGT-1. La matrice MATCO si è dimostrata adatta a sostenere il differenziamento delle cellule CCO in senso simil-colangiocitario solo nella forma di substrato. Infatti, all’analisi d’espressione mediante RT-PCR le cellule incapsulate in MATCO hanno dimostrato dopo trattamento induttivo la sola espressione di RNA messaggero per il marcatore GGT-1 e, all’analisi di morfogenesi, non hanno evidenziato alcuna organizzazione simil tubulare. Le cellule CCO differenziate su coating MATCO hanno acquisito caratteristiche simili a quelle dei colangiociti come dimostrato dall’espressione di mRNA per i marcatori GGT-1, CK19, MMP1, MMP2 e acquaporina 1. Non è stata osservata l’espressione di marcatori quali ALB, INTb4 e fattore HNF1B. Dal presente studio è quindi emerso che, mediante una procedura standardizzata, è possibile isolare da gelatina di Wharton una popolazione cellulare staminale multipotente, dotata di caratteristiche immunofenotipiche stabili, potenziale di crescita a lungo termine in vitro e capace di rispondere allo stimolo differenziativo colangiocitario su piastre di polistirene condizionate o meno con una matrice di collagene 1 e matrigel. L’impianto in vivo in un modello animale di danno biliare consentirà la valutazione del reale potenziale differenziativo delle popolazioni CCO.