V247M alpha-sarcoglycan mutant: uncovering the ERAD pathway of a type I membrane protein

Le proteine non correttamente ripiegate e/o mutate sono riconosciute dal sistema di controllo qualità del reticolo endoplasmatico (ER) (ER-QC) ed eliminate attraverso una specifica via, chiamata degradazione associata al reticolo (ERAD). La selezione avviene attraverso l’identificazione dei difetti strutturali da parte di specifiche proteine coinvolte nel controllo qualità del reticolo. La degradazione conseguente può essere suddivisa in tre vie: ERAD-L per proteine con difetti luminali, ERAD-M per difetti nella porzione di membrana ed ERAD-C in caso di difetti citosolici. Le E3 ubiquitin-ligasi risiedenti nel reticolo sono elementi chiave di ERAD e ciascuna sembra agire prevalentemente in una particolare via piuttosto che in un’altra, assicurando quindi lo specifico riconoscimento e smaltimento di proteine aventi difetti particolari, anche se non è ancora chiaro nei dettagli come ciò avvenga. Nel muscolo, mutazioni a carico di proteine associate in un complesso tetramerico alla distrofina, chiamate sarcoglicani (alpha-beta-gamma-delta), causano nell’uomo distrofie muscolari chiamate distrofie dei cingoli. E’ stato precedentemente dimostrato che il mutante di alpha-sarcoglicano V247M, una proteina di tipo I con un difetto luminale, viene ubiquitinato e degradato dal proteasoma, tappa finale di ERAD. Scopo di questo studio è indagare i componenti del sistema degradativo atti a riconoscere questa proteina come mutante e le E3 ligasi coinvolte nella sua ubiquitinazione, processo fondamentale per l’indirizzamento al proteasoma. Il fine ultimo è chiaramente quello di individuare possibili bersagli farmacologici per lo sviluppo di una possibile terapia, non presente attualmente. Numerose patologie dovute a problemi di ripiegamento/mutazioni di proteine stanno emergendo, e con esse anche possibili trattamenti farmacologici che agiscono sui pathways di ER-QC ed ERAD. Nel reticolo le proteine malripiegate e/o mutate sono ritenute in soluzione da chaperoni e lectine, che giocano un ruolo indispensabile in ER-QC e nel delivery dei substrati ai complessi formati dalle E3 ligasi. Tra questi ho dimostrato che GRP94 è coinvolta nel riconoscimento di V247M alpha-SG, mentre BiP e OS9 non sembrano implicati, anche se ulteriori studi a questo riguardo risultano necessari. In letteratura i substrati modello di proteine di tipo I con difetti luminali vengono degradati grazie all’azione di due E3 ligasi, chiamate gp78 e HRD1. Attraverso l’uso di E3 ligasi mutate nel sito catalitico e di RNAi ho dimostrato che V247M alpha-SG è degradato grazie all’azione di HRD1 ma non di gp78. Mediante saggi di immunoprecipitazione, ho anche dimostrato che HRD1 interagisce strettamente con il sarcoglicano mutato così come UBC6e, l’ubiquitin-coniugasi partner di HRD1, e SEL1L, il recettore associato alla ligasi. Un’altra ligasi, RFP2, si è dimostrata in grado sia di interagire con il sarcoglicano mutato, sia di bloccarne la degradazione se deleta del sito catalitico coinvolto nell’ubiquitinazione. Per permettere a molte delle proteine di membrana di essere estratte dal reticolo e dirette al citosol, dove risiede il proteasoma, la AAA-ATPasi p97 sembra avere un ruolo fondamentale, grazie alla forza motrice fornita dall’idrolisi dell’ATP e il supporto dato da Derlina-1. Ho dimostrato, grazie all’uso di un dominante negativo, che l’azione di p97 è necessaria per la retrotraslocazione di V247M alpha-SG e, grazie ad esperimenti di co-immunoprecipitazione, che il mutante interagisce strettamente sia con p97, sia con Derlina-1. Questi risultati descrivono per la prima volta il pathway degradativo di alpha-sarcoglicano V247M, che, in qualità di proteina di membrana di tipo I con difetti nella porzione luminale, segue la via classica ERAD-L guidata dall’E3 ubiquitin-ligasi HRD1. Nel processo di riconoscimento e indirizzamento al proteasoma questo mutante è inoltre assistito dalla E3 ubiquitin-ligasi RFP2. In un progetto in collaborazione con la Dr. R. Sacchetto (Dip. Scienze Sperimentali Veterinarie), mi sono occupata di un’altra proteina, SERCA1a. La proteina mutata è causa nell’uomo della miopatia di Brody e recentemente un fenotipo muscolare simile, chiamato Pseudomiotonia, è stato riscontrato anche in alcune vacche Italiane di razza Chianina che presentano la mutazione R164H a carico di SERCA1a. Sia nell’uomo che negli animali, la riduzione della attività della calcio ATPasi SERCA1a è correlata alla ridotta quantità di proteina presente nel muscolo. L’espressione eterotopica di SERCA1a mi ha permesso di dimostrare che la proteina è degradata attraverso il proteasoma: l’inibizione dell’attività degradativa porta, infatti, a un aumento della quantità di proteina. Oltre ciò, studi funzionali mi hanno permesso di dimostrare che la proteina così recuperata è anche enzimaticamente attiva, indice del fatto che un suo recupero farmacologico potrebbe risultare efficace non solo nei casi di Pseudomiotonia ma anche in quelli di miopatia di Brody.