IMMUNOTHERAPEUTIC POTENTIAL AND PROGNOSTIC RELEVANCE OF GD T CELL SUBSETS IN PATIENTS AFFECTED BY LIVER METASTATIC COLORECTAL CANCER

Background: More than 50% of patients with primary colorectal carcinoma (CRC) develop liver metastasis (CLM) because of the lack of effective diagnostic and prognostic markers. Gamma delta (γδ) T cells are innate-like lymphocytes with a pivotal role in cancer immunosurveillance due to their broad array of antitumor functions. Human liver resident γδT cells represent up to 20% of total T lymphocytes, however, their specific involvement in CLM remains unknown. Aim: Study of the impact and the immunotherapeutic potential of two main γδT cell subsets, Vδ1 and Vδ2, in CRC progression. Results: In collaboration with The Liver Surgery Unit of Humanitas Research Hospital (HRH), Milan, Italy, biological specimens of CLM patients (N=97) obtained from the peripheral blood (PB), tumor-free and intratumor tissue compartments were analyzed for the frequency, maturation and activation status as well as the effector functions of Vδ1 and Vδ2 T cell subsets. Flow cytometry analysis revealed the selective increase of Vδ1 T cell subset in patients with CLM compared to healthy individuals. By t-SNE analysis, we identified a high expansion of terminally differentiated (TEMRA) Vδ1 T cells in CLM patients characterized by the increased expression of activating and tissue resident marker CD69 and NKG2D receptor, known to regulate γδT antitumor response. The increased percentage of PB Vδ1 CD69pos TEMRA cells in CLM patients resulted to be independent of chemotherapy (CHT) treatment. Indeed, no differences were observed between CHT-treated and -untreated CLM patients, thus indicating a tumor-related alterations in the phenotype of PB Vδ1 T cells. The frequency of CD69pos Vδ1 TEMRA cells in CLM patients strongly correlates between blood and liver tissue compartments indicating their dynamic exchange. Moreover, we observed an increased trend in the occurrence of common TCR clones shared among CD69pos Vδ1 T cells in the blood and liver tissue, compared to their PB CD69neg counterpart. This result further suggests that these cells might origin in the liver. Importantly, the increased occurrence of CD69 expression on liver tissue Vδ1 T cells was associated with lower number of metastases in CLM patients, thus revealing a protective role of this subset in the control of metastatic spreading of CRC to liver. On the other hand, the analysis of Vδ2 T cells in the same cohort of CLM patients showed a major effect of CHT on their phenotype. In particular, we observed a large and persistent senescent CD57posCD28negCD16posTEMRA Vδ2 T cell cluster that was more evident in CHT treated patients compared to both untreated CLM patients and to healthy controls. An important component of this shift was the increased frequency of highly differentiated TEMRA Vδ2 T cells that, along with CD57pos cells, showed better resistance to chemotherapeutic agents. Our study also revealed the induction of a premature CHT-related senescent phenotype that was heavily marked in elderly patients. Moreover, CD57 expression on Vδ2 T cells in CHT patients was associated with an impaired functional response. Indeed, both cytokines production, IFN-γ and TNF-α, and cytotoxic activity were lower compared to the CD57neg counterpart upon PMA/Ionomycin stimulation. Conclusion: Our study revealed the unique immune signatures of Vδ1 and Vδ2 T cell subsets in CLM patients paving the ground for new clinical approaches to improve both prognosis and therapy of CLM.

Background: Più del 50% dei pazienti con carcinoma al colon-retto (CRC) sviluppa metastasi epatiche (CLM) a causa della mancanza di efficaci marcatori diagnostici e prognostici. Le cellule T gamma delta (γδ) sono linfociti con proprietà dell’immunità innata che svolgono un ruolo chiave nell’immunosorveglianza tumorale grazie alla loro elevata attività citotossica. Nel fegato umano le cellule T γδ residenti possono rappresentare fino al 20% dei linfociti T totali, tuttavia, il loro contributo specifico nelle CLM rimane ignoto. Scopo: Studio dell’effetto e del potenziale immunoterapeutico delle due principali sottopopolazioni di cellule T γδ, Vδ1 e Vδ2, nella progressione del CRC. Risultati: In collaborazione con l’Unità di Chirurgia Epatobiliare dell’Istituto Clinico Humanitas (ICH), Milano, Italia, i campioni biologici dei pazienti CLM (N=97) ottenuti dal sangue periferico (SP), tessuto intratumorale e libero da tumore, sono stati analizzati in termini di frequenza, maturazione e stato attivatorio, oltreché funzione effettrice delle cellule T Vδ1 e Vδ2. L’analisi citofluorimetrica ha rivelato un aumento selettivo della sottopopolazione Vδ1 nei pazienti CLM rispetto ai controlli sani. Attraverso l’analisi t-SNE, abbiamo riscontrato nei pazienti l’espansione delle cellule Vδ1 altamente differenziate (TEMRA) con un fenotipo caratterizzato dall’alta espressione del marcatore attivatorio e di residenza tissutale CD69 e del recettore NKG2D, il quale regola la risposta antitumorale delle cellule T γδ. L’aumentata percentuale nel sangue delle cellule Vδ1 TEMRA CD69pos nei pazienti CLM è risultata essere indipendente dalla chemioterapia (CHT). Infatti, non è emersa alcuna differenza tra pazienti trattati e non-trattati, suggerendo l’effetto del tumore sulle alterazioni fenotipiche delle cellule Vδ1 circolanti. La frequenza delle cellule Vδ1 TEMRA CD69pos nei pazienti con CLM correla significativamente tra sangue e tessuto epatico ad indicare il sussistere di uno scambio dinamico tra i due distretti. Inoltre, abbiamo osservato un aumentato numero di cloni condivisi tra sangue e fegato all’interno delle cellule T Vδ1 CD69pos , rispetto alla controparte Vδ1 CD69neg. Il seguente risultato suggerisce ulteriormente l’origine epatica di queste cellule. Infine, l’elevata espressione del recettore CD69 nelle cellule T Vδ1 epatiche è associata ad un minor numero di metastasi nei pazienti CLM, dimostrando il ruolo protettivo di questa sottopopolazione nel controllo della progressione metastatica da CRC. D’altra parte, l’analisi delle cellule T Vδ2, nella stessa corte di pazienti, ha evidenziato l’effetto predominante della CHT sul loro fenotipo. In particolare, abbiamo osservato un cluster di cellule Vδ2 TEMRA senescenti CD57posCD28negCD16pos più evidente nei pazienti CLM trattati con CHT rispetto sia ai non trattati sia ai controlli sani. Il seguente effetto fenotipico è il risultato dell’aumentata percentuale di cellule Vδ2 altamente differenziate che, assieme alla cellule CD57pos, resistono maggiormente agli effetti tossici degli agenti chemioterapici. Il nostro studio dimostra l’induzione precoce di un fenotipo senescente associato alla CHT e particolarmente evidente tra i pazienti più anziani. Inoltre, l’espressione di CD57 da parte delle cellule T Vδ2 nei pazienti trattati con CHT è associata ad una risposta funzionale alterata. Infatti, a seguito della stimolazione con PMA/Ionomicina, sia la produzione delle citochine, IFN-γ e TNF-α, sia l’attività citotossica sono minori rispetto alla controparte CD57neg. Conclusioni: Il nostro studio rivela l’esclusivo profilo immunologico delle cellule Vδ1 e Vδ2 nei pazienti affetti da CLM a favore dello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per migliorare sia la prognosi che la terapia delle CLM.