Studio di una glutation perossidasi del reticolo endoplasmatico

Le cellule vanno continuamente incontro a ‘stress ossidativo’ indotto da radicali liberi. Questi possono essere generati in diversi modi, ad esempio da elettroni che sfuggono alla catena respiratoria mitocondriale, dall'attività delle NADPH ossidasi o dalle ossido nitrico sintasi e dalla autossidazione di flavoenzimi. Tuttavia, i radicali superossido (*O2-) e ossido nitrico (NO*) non appaiono così distruttivi per i tessuti. L'abbondanza di superossido dismutasi (SOD) assicura che l’ *O2- sia immediatamente dismutato a O2 e H2O2, una sostanza apparentemente meno pericolosa. Ciò non toglie che, in condizioni patologiche, l’H2O2 possa essere usata per produrre acido ipocloroso (HOCl) e altri composti reattivi dalle eme perossidasi dei leucociti, oppure per produrre il radicale idrossile (OH*) attraverso la reazione di Fenton. Allo stesso modo, in queste condizioni, il perossinitrito (ONOO-), prodotto di reazione tra NO* e *O2-, si trasforma in specie più tossiche. È interessante notare il fatto che non sia stato mai trovato enzima capace di detossificare OH*, RO*, ossigeno singoletto, oppure HOCl. Evidentemente, la natura è stata saggia abbastanza da non impegnarsi in uno sforzo impossibile, per la difficoltà di competere con l’altissima reattività di queste specie su bersagli biologici, limitata solo dalla diffusione. Tuttavia le cellule devono costantemente affrontare ‘stress ossidativo’ e pertanto l’autoprotezione è obbligatoria. Questa è perseguita prevenendo la formazione di radicali dagli idroperossidi (R-OOH) e dal perossinitrito. Ciò è particolarmente rilevante alla luce del fatto che queste sostanze stanno emergendo come mediatori di diverse risposte fisiologiche quali la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare. Gli enzimi dei mammiferi implicati nella detossificazione degli R-OOH e ONOO- appartengono a due distinte famiglie di proteine, le glutatione perossidasi (GPxs) e le peroxiredossine (Prx). Entrambi agiscono sull’H2O2 o sul ONOO- - anche se, generalmente il ONOO- è ritenuto substrato migliore per le Prx rispetto alle GPxs – e, inoltre, su un ampio spettro di idroperossidi alchilici comprendenti i prodotti della lipossigenasi. Le GPxs sono ampiamente distribuite in natura, dai batteri all'uomo. Utilizzano sia selenio che zolfo nel centro catalitico ossidoriduttivo, che viene ossidato dall’R-OOH, formando così un intermedio ossidato che viene rigenerato da un agente riducente. Questo non è sempre glutatione (GSH), come il nome di questa famiglia di enzimi potrebbe suggerire. Il centro redox delle GPxs è notevolmente conservato in tutta la famiglia ed è costituito da una tetrade catalitica composta da Sec o Cys, Gln, Trp e Asn. Quando contiene selenio, come tipicamente nelle GPx dei mammiferi – le ‘SecGPxs’-, l’intermedio ossidato, formatosi dalla reazione del centro catalitico con l’R-OOH, probabilmente il selenolo (SeO-), viene ridotto dal GSH, il quale forma un intermedio selenodisulfuro che viene poi ridotto da una seconda molecola di GSH, con produzione di GSSG ed enzima ridotto. Quando invece contiene zolfo, come tipicamente nelle GPxs dei non-vertebrati e nelle piante (CysGPxs), il substrato riducente è una preferenzialmente la tioredossina (Trx) o una ‘redossina’ della famiglia delle Trxs, e l'intermedio ossidato dell’enzima è un disolfuro intracatena. Per questo è necessario, oltre alla ‘Cys perossidasica’ (CP), un secondo residuo di Cys la ‘Cys resolving’ (CR). L'attuale, unica SecGPx monomerica nei vertebrati - la GPx4- non presenta il residuo CR, è ridotta dal GSH e ovviamente non forma un intermedio selenodisulfuro intracatena. Il ‘meccanismo canonico’ delle GPxs, che implica quindi una CR quando il centro redox è una CP invece di una Sec perossidasica (UP) e quindi l’uso di preferenziale di Trx o altre ‘redossine’ come substrato riducente, è stato rimesso in discussione dalla scoperta, nei mammiferi, di due nuove GPx, la GPx7 e la GPx8. Queste sono due GPx monomeriche del reticolo endoplasmatico (ER), contenenti una CP, senza un residuo di Cys nello ‘stretch’ di aminoacidi dove si trova la CR delle altre CysGPx dei non-vertebrati e delle piante. In questa tesi, abbiamo caratterizzato la GPx7, come prototipo di queste insolite ‘1CysGPx’. Anche se a bassi livelli, la GPx7 è ampiamente distribuita nei tessuti. Il peptide segnale presente all’estremità NH2-terminale e il motivo C-terminale KREDL sono funzionali per l’ingresso e la ritenzione nell’ER, rispettivamente. Gli studi cinetici sulla GPx7 sono stati effettuati su idroperossidi fosfolipidi (PL-OOH), il substrato più appropriato per le GPxs monomeriche, utilizzando enzima espresso in E. coli, fuso con sinucleina per ottenere alti livelli di espressione. Dalla cinetica in stato stazionario, la costante cinetica per l'ossidazione del sito attivo è risultata piuttosto elevata (k+1=9.5 x E03 M-1sec-1), mentre costante cinetica per la rigenerazione del catalizzatore con GSH notevolmente bassa (k’+2=12.6 M-1sec-1). Sorprendentemente, il sito attivo ossidato è invece rapidamente ridotto da una ‘redossina’, la protein disulfide isomerase (PDI) (k’+2=3.5 x E03 M-1sec-1) ma non dalla Trx. L’interazione PDI-GPx7 è stata confermata dalla misura della costante di affinità della GPx7 per la PDI mediante SPR (KD= 5.2 µM). Inoltre è stata esclusa, mediante mutagenesi, la eventuale presenza nella GPx7 di un residuo Cys che possa fare la funzione della CR tipica delle GPxs dei non-vertebrati e delle piante. Quindi, il ‘meccanismo canonico’ mediante il quale nelle GPxs è richiesta una CR per essere ridotte da una ‘redossina’ non si applica alla GPx7 (e probabilmente neanche alla GPx8, che è strutturalmente simile). Questo enzima infatti, accetta elettroni da un ‘redossina’ come la PDI attraverso un meccanismo che implica la sola CP. La GPx7 (e la GPx8) si configurano quindi come insolite ‘1CysGPx’ della famiglia delle glutation perossidasi, poiche’ sono di fatto rare eccezioni. Infatti, la famiglia delle glutation perossidasi è per la maggior parte composta da ‘2CysGPx’ dei non-vertebrati e delle piante che sono funzionalmente Trx perossidasi. Sebbene questi dati sembrerebbero inquadrare la funzione fisiologica della GPx7 nel ‘protein folding’ che avviene nell’ER, nessuna evidenza è stata da noi ottenuta in questo senso. In cerca di una risposta adattativa alternativa all’unfolded protein response (UPR), abbiamo osservato un aumento di fosforilazione della extracellular signal regulated kinase 1-2 (ERK 1-2) in seguito al silenziamento della GPx7 dopo uno stimolo proliferativo con il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). Questi dati finalizzano la caratterizzazione enzimatica della GPx7 come un membro ‘non-canonico’ della famiglia delle GPxs, non suggeiscono un ruolo nello stress del ER, ma indicano invece un ruolo nel cross talk tra lo stato redox del ER e segnali provenienti da fattori di crescita.