Analysis of the molecular mechanisms of the antineoplastic effect of ouabain

L’ouabaina é un glicoside cardioattivo la cui azione più nota è l’inibizione della Na/K ATPasi, enzima ubiquitario della membrana plasmatica responsabile del trasporto di ioni Na e K attraveso le membrane utilizzando ATP come forza motrice. È stato dimostrato che la Na/K ATPasi, oltre alla sua funzione di pompa, é in grado di agire come recettore, attivando varie cascate di segnale (Liu and Xie, 2010). Studi recenti hanno dimostrato che i glicosidi cardioattivi inibiscono in maniera selettiva la proliferazione e/o inducono apoptosi in diverse linee di cellule tumorali (Schoner and Sheiner-Bobis, 2007). Questi studi in vitro sono supportati da dati epidemiologici che evidenziano una protezione da vari tipi di cancro in pazienti trattati con glicosidi cardioattivi (Stenkvist, 1999; Haux 1999; Haux et al, 2001). Al fine di chiarire il meccanismo molecolare e cellulare alla base dell’effetto citotossico dei glicosidi cardioattivi sulle cellule tumorali, abbiamo studiato gli effetti dell’ouabaina (1-100 nM) nei confronti di due linee cellulari tumorali, le Jurkat (una linea proveniente da un linfoma a cellule T) e le A549 (linea ottenuta da carcinoma bronchiolo-alveolare). Il trattamento con ouabaina (1-20 nM) provocava una diminuzione della proliferazione cellulare concentrazione dipendente in entrambe le linee cellulari. Alle concentrazioni più elevate (50-100 nM) l’ouabaina era citotossica per le due linee cellulari testate, come dimostrato dall’aumento di cellule Annessina V/propidio positive. Alle stesse concentrazioni l’ouabaina non alterava la vitalità delle cellule mononucleate estratte da sangue periferico umano (PBMC) e, come già dimostrato nel nostro laboratorio, proteggeva dall’apoptosi le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) (Trevisi L et al., 2004). Il trattamento con ouabaina induceva l’attivazione delle chinasi Src ed ERK1/2 in entrambe le linee cellulari, confermando così la stimolazione della nota cascata di segnale innescata dala Na/K ATPasi. Tuttavia, l’inibizione farmacologica della Src o della MEK non contrastava l’effetto citotossico dell’ouabaina. In entrambe le linee cellulari il trattamento con ouabaina induceva una diminuzione della fosforilazione di Akt. In entrambe le linee cellulari, la diminuzione della proteina antiapoptotica Bcl-2 e del potenziale di membrana mitocondriale costituivano gli eventi iniziali a seguito del trattamento con ouabaina. Tuttavia, solo nelle Jurkat sono stati riscontrati alcune marcatori dell’apoptosi caspasi-dipendente quali l’attivazione delle caspasi 3/7, la tipica frammentazione del DNA (DNA ladder) e l’inibizione della morte cellulare indotta dall’inibitore pan caspasico Z-VAD-fmk. Al contrario nelle A549 sono stati riscontrati i classici marcatori di autofagia come la conversione di LC3 dalla forma LC3-I alla isoforma LC3-II. Inoltre l’ouabaina aumentava il flusso autofagico nelle A549, come dimostrato dall’aumento della degradazione di p62 e dall’aumento delle forme puntate di LC3 in caso di co-incubazione con clorochina, un inibitore della fusione lisosomi-autofagosomi. Infine la morte cellulare indotta da ouabaina era bloccata dal trattamento con l’inibitore dell’autofagia 3-metiladenina. È stato ipotizzato che la diminuzione della Bcl-2 induca autofagia in quanto la Bcl-2 interagisce con Beclin 1 prevenendo così la formazione del complesso di iniziazione (Pattingre S et al., 2005). Tale interazione è regolata da JNK, la quale fosforilando Bcl-2, causa la sua degradazione e la rottura del complesso Bcl-2/Beclin 1. Nelle A549 trattate con ouabaina i livelli di Beclin 1 erano costanti, ma l’inibizione di JNK con SP600125 bloccava la morte cellulare. Noi ipotizziamo che l’attivazione di JNK da parte dell’ouabaina nelle A549 riduca i livelli di Bcl-2 permettendo il rilascio di Beclin 1 e di conseguenza attivi il processo di autofagia. Ulteriori studi saranno necessari per chiarire questo punto. Infine, attraverso l’analisi western blotting è stata studiata l’espressione delle varie isoforme della subunità α della Na/K ATPase nelle due linee tumorali studiate (A549 e Jurkat) e paragonata a quella di due linee normali (HUVEC e PBMC), allo scopo di verificare se le differenze nella sensibilità all’ouabaina fra cellule normali e tumorali possano essere ascritte ad uno specifico tipo di espressione della varie isoforme della subunità α. I nostri risultati indicano che l’isoforma α1 è ubiquitaria, l’isoforma α2 non è espressa solo nei PBMC mentre l’isoforma α3 è espressa solo nelle due linee cellulari tumorali. Questo dato suggerisce che la subunità α3 possa essere determinante per gli effetti citotossici dei glicosidi cardioattivi nei confronti delle cellule tumorali.