Rilevanza biologica e pre-clinica del recettore tirosin chinasico ALK nel rabdomiosarcoma

Il rabdomiosarcoma (RMS) è il più comune sarcoma pediatrico dei tessuti molli che si sviluppa come conseguenza dell’alterazione dei pathways che controllano la crescita e la differenziazione dei precursori del tessuto muscolare striato. Il RMS presenta due principali sottotipi istologici: il rabdomiosarcoma alveolare (ARMS) ed embrionale (ERMS). Il RMS alveolare è associato ad una più spiccata tendenza alla disseminazione, necessita di un regime terapeutico più aggressivo e presenta una prognosi sfavorevole. Comprende circa il 20% dei casi ed è caratterizzato da traslocazioni cromosomiche specifiche, t(2;13)(q35;q14) e t(1;13)(p36;q14), le quali danno origine alle proteine di fusione PAX3-FKHR e PAX7-FKHR, rispettivamente. A differenza degli ARMS, i RMS embrionali costituiscono l’80% dei casi, sono più frequenti nei bambini più piccoli, sono associati a perdita di eterozigosi al locus 11p15.5, ma hanno una prognosi migliore. Attualmente, l’analisi di alterazioni genetiche è usata per una corretta e rapida diagnosi dei RMS, anche se non sono ancora stati trovati fattori e biomarkers prognostici che possano essere utilizzati per incrementare la sopravvivenza dei pazienti. Recentemente è stata descritta l’espressione delle chinasi ALK nei RMS, ma il suo ruolo rimane sconosciuto. ALK è un recettore tirosin-chinasico (RTK) descritto come proteina di fusione costitutivamente attiva NPM-ALK nei linfomi anaplastici (ALCL) e come proteina di membrana è espressa nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico durante lo sviluppo embrionale. Recentemente ALK è stato descritto anche in diversi tumori maligni, come nel glioblastoma e nel neuroblastoma frequentemente associato ad aberrazioni geniche quali amplificazioni o mutazioni puntiformi. ALK è costituito da una regione extracellulare in cui si legano i substrati, un dominio trans-membrana e un dominio chinasico catalitico. Come per altri RTK, l’attivazione di ALK necessita di una dimerizzazione ligando-dipendente, in cui i domini chinasici si fosforilano a vicenda e attivano vie di segnale critiche per la proliferazione e sopravvivenza cellulare, come MAPK ERK1/2 e PI3K AKT. I fattori di crescita che determinano la dimerizzazione e l’attivazione di ALK sono ancora sconosciuti, anche se recentemente sono stati proposti pleiotropina (PTN) e midkine (MK) come possibili ligandi. In questo studio, abbiamo valutato la rilevanza biologica e pre-clinica di ALK nei RMS, dal momento che è stato descritto per la prima volta in linee cellulari di RMS, ma la sua funzione non è mai stata studiata. L’espressione di ALK è stata valutata in 9 linee cellulari di RMS, 4 ERMS e 5 ARMS, mediante Real Time PCR e western blotting, osservando che ALK è maggiormente espresso nelle linee di RMS alveolare che esprimono l’oncogene PAX-FKHR. Tuttavia, ALK risulta inattivo nelle cellule di RMS, a differenza di NPM-ALK negli ALCL o di EML4-ALK in NSCLC, e per la sua attivazione necessita di una dimerizzazione ligando-dipendente. I risultati ottenuti nel nostro laboratorio indicano però che PTN e MK non sono in grado di attivare ALK nelle linee cellulari di rabdomiosarcoma suggerendo meccanismi di regolazione diversi da quelli finora descritti. Infatti non si osservano né la fosforilazione a livello delle tirosine presenti nel sito chinasico né l’attivazione delle vie di segnale. Per capire il ruolo di ALK, è stato quindi utilizzato un anticorpo monoclonale agonista (mAb16-39) in grado di legarsi al dominio extracellulare di ALK e stimolarne la dimerizzazione. In queste condizioni, è stato possibile osservare un aumento della fosforilazione di ALK e di proteine implicate nei fenomeni di proliferazione e sopravvivenza cellulare tumorale (MAPK; PI3K/AKT). L’inibizione di ALK determina una diminuzione della fosforilazione di ALK, e della trasduzione del segnale che risulta in un aumento della morte cellulare programmata (apoptosi). In conclusione il ruolo di ALK nei RMS rimane ancora largamente sconosciuto, anche se i nostri dati sembrano suggerire un ruolo importante di ALK nella tumorigenesi del RMS.