Central nervous system neuronal surface antibody-associated syndromes. Clinical and Laboratory Characterization

Il concetto di sindromi del sistema nervoso centrale (SNC) associate ad anticorpi è relativamente recente. Si ritiene che le classiche sindromi paraneoplastiche neurologiche abbiano una patogenesi immunitaria prevalentemente cellulo-mediata e che gli anticorpi onconeurali costituiscano semplicemente dei biomarker. Sulla base di questo assunto si è ritenuto a lungo improbabile che autoanticorpi potessero determinare malattie del SNC. Recentemente si è resa sempre più evidente l’esistenza di sindromi del SNC associate ad anticorpi diretti contro antigeni presenti sulla superficie neuronale e pertanto potenzialmente patogenetici. L’identificazione negli ultimi dieci anni di forme di encefaliti autoimmuni con anticorpi diretti contro antigeni della superficie neuronale, ed in particolare le proteine del complesso dei canali del potassio voltaggio-dipendenti (VGKC-complex) e i recettori del glutammato di tipo NMDA, ha dimostrato l’esistenza di sindromi del SNC, generalmente non associate alla presenza di neoplasie, che possono essere anticorpo-mediate e pertanto potenzialmente trattabili. Lo spettro clinico di queste malattie non è stato ancora pienamente esplorato, vi potrebbero essere altre malattie che devono ancora essere scoperte, e vi sono forme di epilessia o sindromi psichiatriche che potrebbero avere una base autoimmune. Definiamo questi anticorpi neuronal surface antibodies (NSAbs) e le malattie ad essi associate NSAS (Neuronal Surface Antibody Syndrome). Lo scopo della ricerca effettuata in questo percorso di tre anni di dottorato è stato la caratterizzazione clinica e laboratoristica di alcune NSAS. Il primo anno di dottorato è stato effettuato presso l’Università di Oxford sotto la supervisione della Prof. Angela Vincent. Durante questo periodo ho contribuito alla caratterizzazione delle due più importanti forme di NSAS, le encefaliti associate ad anticorpi anti-VGKC-complex e ad anti-NMDAR. I risultati di questi studi sono stati pubblicati (Irani et al., Brain 2010 a e b). Il mio personale contributo è consistito nello sviluppo e ottimizzazione di tecniche di immunofluorescenza per l’identificazione di NSAbs, utilizzando sia colture primarie di neuroni ippocampali che cellule di mammifero transfettate con l’antigene di interesse. Inoltre durante il soggiorno presso il laboratorio di Oxford ho cercato di mettere a punto un approccio di proteomica per l’identificazione di nuovi NSAbs mediante immunoprecipitazione e spettrometria di massa. Tale approccio è stato successivamente applicato nello screening di pazienti con sindromi cerebellari autoimmuni. I risultati di questo studio sono descritti nella terza parte della tesi. La tesi di dottorato è divisa in tre parti. Nella prima parte ho esaminato lo stato dell’arte delle sindromi associate ad anticorpi contro antigeni di superficie iniziando con un confronto tra disordini associati ad anticorpi contro antigeni intracellulari e antigeni di superficie. Ho quindi riassunto i maggiori aspetti clinici e paraclinici delle sindromi che sono state già identificate, e da queste osservazioni ho disegnato delle linee guida per il futuro riconoscimento di queste e altre condizioni potenzialmente mediate da NSAbs. Il lavoro di stesura di queste linee guida è stato supervisionato dalla Prof. Angela Vincent e riesaminato criticamente dai Prof. Francesc Graus (Barcelona, Spain) e Prof. Christian Bien (Bielefeld, Germany) e dal Dr. Bruno Giometto (Treviso, Italy). La seconda parte della tesi descrive la caratterizzazione clinica e immunologica di una coorte di pazienti con sospetta encefalite autoimmune e anticorpi anti-VGKC-complex che ho raccolto ed esaminato a Padova nei 3 anni di dottorato. Recentemente è stato dimostrato dal gruppo di lavoro di Oxford che la maggior parte degli anticorpi precedentemente attribuiti ai canali del potassio VGKC (mediante immunoprecipitazione) in realtà hanno come bersaglio due proteine canale complessate con i VGKC, Lgi1 e Caspr2; anticorpi diretti contro queste due proteine tendono ad associarsi rispettivamente con encefalite limbica (EL) e sindrome di Morvan (vedi Irani et al. Brain 2010b). Ho quindi deciso di focalizzare la mia indagine su pazienti con encefaliti autoimmuni associate ad anticorpi anti-VGKC-complex con l’obiettivo di riportare il profilo clinico e immunologico di questi pazienti e possibilmente dimostrare una correlazione tra antigene e fenotipo. Durante i tre anni di dottorato ho analizzato 503 campioni da 366 pazienti con sospetta encefalite autoimmune inviati al nostro laboratorio tra gennaio 2005 e dicembre 2011: 279 campioni di siero (e/o di liquido cerebrospinale) da 232 pazienti sono stati testati per anti-VGKC-complex; inoltre 226 campioni sono stati testati per anticorpi anti-NMDAR, 59 per anti-AMPAR1 e 2 e GABAbR, 91 per anti-GAD; 21 campioni inoltre sono stati testati su neuroni ippocampali. Le metodiche di screening hanno incluso: radioimmunoprecipitazione (RIA) per anti-VGKC e -GAD65; immunofluorescenza indiretta (IFI) su cellule transfettate con NMDAR, AMPAR1, AMPAR2, GABAbR, Lgi1 and Caspr2; IFI su neuroni ippocampali. I dati raccolti dai pazienti risultati positivi per anti-VGKC-complex sono quindi stati analizzati. Trentadue pazienti su 232 testati sono risultati positivi per anti-VGKC-complex. Informazioni cliniche sono risultate disponibili per 18 pazienti: 10 positivi per anti-Lgi1, 3 per anti-Caspr2 mentre 5 sono risultati positivi su RIA ma non su IFI. Due pazienti hanno presentato un quadro sindromico compatibile con la sindrome di Morvan, in un caso in associazione ad anti-Lgi1 e nell’altro ad anti-Caspr2 e timoma. In tutti i pazienti in cui è stato somministrato un trattamento immunomodulante si è assistito ad un miglioramento clinico con l’eccezione di una paziente deceduta a causa di un microcitoma polmonare. Un titolo anticorpale persistentemente elevato nonostante la remissione clinica in una paziente con EL e anticorpi anti-Lgi1 ha condotto all’individuazione e alla successiva rimozione di un timo iperplastico; un paziente con anti-Caspr2 ha manifestato un’encefalite di grado lieve in concomitanza di una sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi; un altro paziente con una forma di encefalomielite responsiva al trattamento è risultato negativo in IFI ma ha presentato un alto titolo anticorpale per anti-VGKC su RIA. Un ipermetabolismo dei gangli della base è stato individuato in 4 pazienti con anti-Lgi1, in un caso associato alla presenza di crisi epilettiche distoniche facio-brachiali. In conclusione i risultati di questo studio hanno esteso lo spettro delle manifestazioni cliniche note associate ad anticorpi anti-VGKC-complex. E’ stato dimostrato che le EL con anti-VGKC possono associare non solo a timomi ma anche ad iperplasia del timo, in maniera analoga a quanto avviene nella miastenia gravis. La persistenza di un alto titolo anticorpale dovrebbe pertanto indurre un accurato imaging del timo. La terza parte della tesi descrive uno studio sperimentale che ha avuto lo scopo di identificare nuovi autoanticorpi nelle sindromi cerebellari di possibile origine autoimmune. La Dr.ssa Esther Becker dell’Università di Oxford ha contribuito in egual misura al sottoscritto in questo studio. Pochi studi in precedenza avevano ricercato anticorpi potenzialmente patogenetici in pazienti non paraneoplastici con atassia cerebellare. Inizialmente 52 pazienti con atassia cerebellare idiopatica sono stati sottoposti a screening mediante immunofluorescenza su neuroni cerebellari. Un siero che ha dimostrato un intensa reattività sui neuroni è stato selezionato per gli esperimenti di immunoprecipitazione e spettrometria di massa. Tale approccio ha portato all’identificazione di Caspr2 (contactin-associated protein 2) come maggiore antigene. Anticorpi anti-Caspr2 sono stati poi identificati mediante immunofluorescenza su cellule transfettate in 9 pazienti su 88 con atassia (10%), in confronto a 3 pazienti su 144 di controllo affetti da sclerosi multipla o demenza. Caspr2 è altamente espresso nel cervelletto, e solo in parte in associazione ai canali del potassio voltaggio-dipendenti. Studi prospettici saranno necessari per valutare se l’identificazione di anticorpi anti-Caspr2 abbia valore nella diagnosi e trattamento delle sindromi cerebellari.