DEREGULATION OF UV-ACTIVATED INFLAMMASOME BY HPV 38 IN HUMAN KERATINOCYTES

Non-melanoma skin cancers (NMSC) are the most common human malignancies occurring in fair-skinned adult population, representing approximately 30% of total cancer. The etiology of this cancer is multifactorial, since genotypic, phenotypic and/or environmental factors can be involved in its development. Several studies have reported that the exposure to ultraviolet irradiation (UVB) represents a key risk factor in the development of skin cancer. Furthermore, infectious agents could be an additional risk factor and this hypothesis is supported by the evidence that immunocompromised people, e.g. organ transplant recipients (OTRs), show a higher risk of developing NMSC compared with immunocompetent individuals. Several infectious agents are able to colonize the skin and especially a subgroup of beta cutaneous human papillomavirus (HPV) is considered the most likely additional etiological factors of NMSC. In particular, the presence of β-HPV has been reported in patients with a rare cell-mediated immunity disorder, called epidermodysplasia verruciformis (EV), which causes high rates of susceptibility to develop skin squamous cell carcinoma (SCC) on sun-exposed areas. Thus, it provided the initial clues about infectious agents, such as β HPV, as potential additional risk factor for NMSC. Several studies have demonstrated the transforming properties of the viral oncoproteins, E6 and E7, in in vitro and in vivo experimental models. Both proteins, altering the functions of tumour suppressor gene products, e.g. p53 and retinoblastoma (pRb), are able to deregulate key cellular events, such as cell cycle, DNA repair, apoptosis and senescence. Based on these in vitro results, our group has generated a transgenic (Tg) mouse model that express E6 and E7 oncogenes from beta HPV38 in the basal level of the skin and mucosal epithelia. Those mice were highly susceptible to UV-radiation; in fact, the exposure of HPV38 E6/E7 Tg mice to UVB caused the development of actinic keratosis-like lesions that are considered as precursors of SCC in humans and a few week later SCC. Conversely, the wild-type mice did not develop any type of skin lesions when exposed to the same dose of UV radiations. However, the mechanism of the UV/HPV38 cooperation has not been elucidated yet. The aim of this work thesis was to dissect the molecular mechanisms of such cooperation. We have first determined whether the expression of the viral oncogenes in the Tg animals alters the pattern of gene expression induced by UV radiation. The analysis of the entire transcriptome pointed out that more than 300 genes are deregulated in the Tg mice after UVB exposure, compared to the wild type animals. In particular, the HPV38 E6 and E7 oncoproteins were able to down regulate the expression of proteins involved in the inflammasome complexes or the downstream effectors, such as IL-18. Interestingly, many studies in keratinocyte cell lines provided evidence that UV radiation activate the inflammasome pathway, leading the secretion of specific pro-inflammatory cytokines, like IL-1β and IL-18. RT-qPCR experiments confirmed the transcriptome findings, showing that IL-18 expression is up-regulated in wild-type mice after UV exposure, while it is strongly inhibited in HPV38 E6/E7 Tg mice. Using primary human keratinocytes (HPKs) as experimental models, we dissected the mechanisms involved in the UV-induced IL-18 expression as well as the role of HPV38 in the deregulation of these events. RT-qPCR analysis showed an UV-induced upregulation of IL-18 mRNA expression as well as some key inflammasome components, like AIM2 and ASC, in HPKs cells; conversely, the presence of E6 and E7 oncoproteins strongly down regulated IL-18 both at the expression and secretion levels. Using another in vitro experimental model, such as keratinocytes expressing the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT), in order to prolong the life span of the cells, we found that this cell line presents a higher basal level of IL-18 compared to HPKs and the presence of E6 and E7 plays an inhibitory role. Transient transfection experiments in hTERT HPKs using a vector containing the isolated IL-18 promoter cloned in front the luciferase reporter gene confirmed the ability of HPV38 E6 and E7 to repress the IL-18 promoter activity. The analysis of IL-18 promoter by TFBIND bioinformatics tool revealed the presence of 15 putative binding sites for p53, which is well known to be activated by UV radiation. Performing chromatin immunoprecipitation assays (CHIP), we showed that p53 is recruited to two distinct regions of the IL-18 promoters that includes four p53 responsive elements. Importantly, HPV38 E6 and E7 efficiently prevent p53 recruitment to these IL-18 promoter regions. Together these results corroborated our hypothesis that beta HPV38 play an important role in the inhibition UV-induce inflammasome response, by altering the gene expression and the production of proteins involved in the inflammasome pathways as well as of specific cytokines (e.g. IL-18). Most likely, the down regulation of IL-18 may impair the ability of the keratinocytes to recruit the immune cell population at the UV-exposed area, causing a defect in the elimination of cells harboring DNA damage. In conclusion, all these alterations may lead to the accumulation of UV-induced DNA damage and development of non-melanoma skin cancer.

I carcinomi spinocellulari (o a cellule squamose) sono le malattie umane più comuni che si verificano negli adulti di carnagione chiara e rappresentano circa il 30% dei tumori totali nel mondo. L'eziologia di questo tipo di cancro è multifattoriale, dal momento che fattori genotipici, fenotipici e/ o ambientali possono essere coinvolti nel suo sviluppo. Diversi studi hanno messo in evidenza che l'esposizione ai raggi ultravioletti (UVB) rappresenta un fattore di rischio chiave nello sviluppo del cancro della pelle. Inoltre, gli agenti infettivi potrebbero costituire un ulteriore fattore di rischio, ipotesi sostenuta dal fatto che i pazienti immunocompromessi, quali ad esempio i soggetti che hanno subito un trapianto di organo (OTR), mostrano un rischio più elevato di sviluppare carcinomi spinocellulari rispetto agli individui immunocompetenti. Molti agenti infettivi sono in grado di colonizzare la pelle e in particolare un sottogruppo di beta papillomavirus umani a tropismo cutaneo (β-HPV) è considerato il fattore eziologico più probabile nello sviluppo del carcinoma a cellule squamose. In particolare, la presenza di β-HPV è stata riportata nei pazienti affetti da un raro difetto dell’immunità cellulo-mediata, chiamato epidermodisplasia verruciformis (EV), che causa un’elevata suscettibilità allo sviluppo del carcinoma a cellule squamose della pelle (SCC). Questo costituisce la prova iniziale secondo la quale gli agenti infettivi, come β-HPV, rappresenterebbero un potenziale fattore di rischio supplementare nello sviluppo dei tumori spinocellulari. Diversi studi hanno dimostrato le proprietà trasformanti delle oncoproteine virali, E6 e E7, sia in modelli sperimentali in vitro che in vivo. Entrambe le proteine, alterando le funzioni di proteine cellulari, quali p53 e pRb, sono in grado di deregolare diversi eventi cellulari chiave, come il ciclo cellulare, la riparazione del danno del DNA, l'apoptosi e la senescenza. Sulla base di questi risultati in vitro, il nostro gruppo ha generato un modello animale di topi transgenici (Tg) che esprimono le proteine virali E6 e E7 di HPV38 nello strato basale della pelle e nella mucosa epiteliale. Questi topi hanno mostrato un’elevata suscettibilità alla radiazione UV; infatti, la loro esposizione ai raggi UVB causa lo sviluppo di lesioni attiniche simili alla cheratosi che sono considerati come precursori del carcinoma a cellule squamose della pelle nell'uomo, e alcune settimane dopo hanno sviluppato il carcinoma conclamato. Al contrario, i topi wild-type non hanno sviluppato alcun tipo di lesioni cutanee quando sono stati esposti alla stessa dose di radiazioni UV. Tuttavia, il meccanismo della cooperazione tra UV e HPV38 non è stato ancora chiarito e l’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di esaminare i meccanismi molecolari di tale sinergismo. A tale scopo, abbiamo valutato se l'espressione degli oncogeni virali negli animali transgenici potesse alterare l'espressione genica indotta dalle radiazioni UV. L'analisi dell'intero trascrittoma ha rilevato che più di 300 geni sono deregolati nei topi transgenici dopo l'esposizione ai raggi UVB, rispetto agli animali wild-type. In particolare, le oncoproteine E6 e E7 sono in grado di deregolare l'espressione di proteine coinvolte nella formazione dei complessi dell’inflammosoma o dei loro effettori a valle, come IL-18. È interessante notare che molti studi condotti su linee cellulari di cheratinociti hanno dimostrato che le radiazioni UV attivano l’inflammosoma, portando alla secrezione di specifiche citochine pro-infiammatorie, come IL-1β e IL-18. I risultati ottenuti tramite RT-qPCR hanno confermato i dati dell’analisi del trascrittoma, mostrando che l'espressione dell’IL-18 è regolata nei topi wild-type dopo l'esposizione a UV, mentre è fortemente inibita nei topi transgenici. Successivamente, utilizzando i cheratinociti umani primari (HPKs) come modello sperimentale, abbiamo analizzato i meccanismi coinvolti nell'espressione dell’IL-18 indotta dai raggi UV, nonché il ruolo di HPV38 nella deregolazione di questi eventi. I cheratinociti primari umani in seguito all’irradiazione con raggi UV mostravano un aumento dei livelli di espressione di mRNA dell’IL-18 e di altri componenti chiave dei complessi dell’inflammosoma, quali AIM2 e ASC; al contrario, la presenza delle proteine virali E6 e E7 riduceva fortemente l’espressione dell’IL-18 sia a livello di espressione di mRNA che di secrezione. L’utilizzo di cheratinociti esprimenti il gene della telomerasi umano (hTERT), al fine di prolungare il ciclo vitale delle cellule, quale modello sperimentale in vitro alternativo, ha messo in evidenza un elevalto livello basale di mRNA di IL-18 rispetto ai cheratinociti primari; inoltre, la presenza di E6 e E7 svolge un ruolo inibitorio su tale espressione. L’espressione transiente di un vettore contenente il promotore isolato dell’IL-18 clonato davanti al gene reporter della luciferasi, in cheratinociti esprimenti il gene hTERT, ha confermato la capacità di E6 e E7 di HPV38 di reprimere l'attività del promotore dell’Interleuchina 18. Inoltre, l'analisi del promotore dell’ IL-18, mediante l’utilizzo del programma bioinformatico TFBIND, ha rivelato la presenza di 15 putativi siti di legame per p53, classicamente attivato dalle radiazioni UV. Eseguendo test di immunoprecipitazione della cromatina (CHIP), abbiamo dimostrato che p53 viene reclutato in due distinte regioni del promotore dell’IL-18, che comprendono quattro elementi responsivi per p53. Le proteine E6 e E7 di HPV38 impediscono in modo efficace il reclutamento di p53 su queste regioni del promotore dell’IL-18. Questi risultati corroborano la nostra ipotesi circa la possibilità che β-HPV38 svolga un ruolo importante nell'inibizione della risposta dell’inflammosoma indotta dai raggi UV; in particolare, il virus potrebbe alterare l'espressione genica e la produzione di proteine coinvolte nella formazione del complesso dell’inflammosoma così come di citochine specifiche (quali ad esempio IL-18). Altresì, la riduzione della regolazione dell’IL-18 potrebbe compromettere la capacità dei cheratinociti di reclutare le cellule del sistema immunitario nell'area esposta ai raggi UV, causando un difetto nell'eliminazione delle cellule che hanno subito un danno al DNA. In conclusione, tutte queste alterazioni potrebbero determinare l'accumulo di danni al DNA indotti dall’esposizione ai raggi UV e allo sviluppo del cancro a cellule squamose della pelle.