Development of lentiviral vectors expressing multiple small interfering RNAs as a gene therapy approach against HIV-1 infection

Nonostante l’impiego di associazioni di farmaci nel corso dell’infezione da HIV-1 determini una riduzione della carica virale e ritardi la progressione della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), la tossicità dei farmaci, la comparsa di virus resistenti e la persistenza del virus in specifici compartimenti anatomici e cellulari rappresentano una sfida per il controllo a lungo termine dell’infezione. In tale contesto si inserisce il crescente interesse della comunità scientifica allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Il primo importante successo nella cura dell’infezione da HIV-1 è stato ottenuto in seguito al trapianto allogenico, in un paziente leucemico HIV positivo, di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) naturalmente resistenti all’infezione a causa di una mutazione a livello del corecettore virale CCR5. Tuttavia, il potenziale rischio di rigetto e la difficoltà di reperire donatori compatibili, non consentono l’adozione diffusa di questo approccio. Il risultato ottenuto supporta, invece, l’idea che la modificazione genetica delle HSC, che rappresentano i precursori di tutte le cellule coinvolte nella patogenesi dell’infezione da parte di HIV-1, possa generare un sistema immunitario permanentemente resistente al virus. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi approcci di terapia genica finalizzati all’espressione di geni anti-HIV-1 nelle HSC. Tra questi, gli approcci basati sulla tecnica dell’RNA interference (RNAi) rappresentano un potente strumento in grado di inibire la replicazione virale. Partendo da questi presupposti, lo scopo del presente studio consiste nello sviluppo di vettori lentivirali esprimenti small interfering RNA (siRNA) in grado di inibire la replicazione di HIV-1 e di testarne l’efficacia in cellule primarie umane fisiologicamente rilevanti per l’infezione virale, tra cui macrofagi e linfociti T CD4+. L’obiettivo ultimo del più ampio progetto di ricerca, in cui si inserisce questo lavoro, è l’impiego dei vettori antivirali più efficaci per la manipolazione genetica di HSC derivanti da pazienti HIV positivi affetti da linfoma. Questi pazienti rappresentano, infatti, un’opportunità unica per valutare una terapia anti-HIV-1 basata sull’impiego di HSC ingegnerizzate in un contesto clinico eticamente accettabile, poichè sono spesso sottoposti a trapianto di HSC. A causa dell’elevato tasso di mutazione associato alla replicazione di HIV-1, sono necessarie strategie terapeutiche combinatorie al fine di ridurre il rischio di insorgenza di resistenze. Pertanto, sono state selezionate le seguenti molecole in grado di inibire diverse fasi del ciclo biologico virale: due short hairpin RNA, codificanti un singolo siRNA diretto contro il trascritto del gene cellulare CCR5 (shCCR5) o del gene virale vif (shvif) e una long hairpin RNA, codificante due siRNA diretti contro il trascritto comune del primo esone dei geni virali tat e rev (lhtat/rev). Nella prima parte del lavoro, sono stati ottenuti vettori codificanti le singole unità trascrizionali esprimenti shCCR5, shvif e lhtat/rev sotto il controllo di diversi promotori umani della polimerasi III, tra i quali U6, 7SK e H1. È stata, quindi, valutata l’attività di silenziamento genico dei singoli siRNA, allo scopo di identificare la migliore combinazione di promotore-siRNA per il successivo sviluppo di approcci antivirali combinatori. In seguito, gli siRNA sopradescritti sono stati clonati tutti all’interno di uno stesso vettore sottoforma di unità trascrizionali indipendenti. In particolare, al fine di ottimizzare il design dei vettori, sono state ottenute multiple piattaforme combinatorie, che differiscono l’una dall’altra per i promotori che guidano l’espressione degli siRNA e per la posizione delle unità trascrizionali. Poiché la presenza di promotori multipli potrebbe causare la saturazione del pathway cellulare di biogenesi dei microRNA, è stata sviluppata una strategia combinatoria alternativa, basata sull’impiego di extended shRNA (e-shRNA). Questa molecola è in grado di esprimere sotto il controllo di un singolo promotore i tre siRNA contro i trascritti dei geni CCR5, vif e tat/rev. Lo studio dell’attività antivirale delle diverse piattaforme combinatorie ha portato all’identificazione di due vettori (U6shCCR5-7SKshvif-H1lhtat/rev e H1e-shRNA) in grado di inibire efficientemente la replicazione di HIV-1 sia in linee cellulari, che in cellule primarie umane, in assenza di citotossicità. Nel complesso, i risultati ottenuti evidenziano aspetti importanti che devono essere presi in considerazione per lo sviluppo di approcci combinatori basati su RNAi finalizzati all’inibizione della replicazione di HIV-1. Il presente studio ha portato, inoltre, all’identificazione di nuove piattaforme combinatorie anti-HIV-1 che potrebbero essere testate in futuri studi clinici, una volta accertata la loro efficacia e sicurezza in vivo nel modello animale.