Design, synthesis and biochemical characterization of Fingolimod analogs for targeting PP2A

PP2A (Protein Fosfatasi 2A) è una serin/treonin fosfatasi espressa in maniera ubiquitaria e altamente conservata tra le specie (eucarioti in primis). Essa è coinvolta in delicati pathway di segnalazione cellulare, ed ha come effetto complessivo quello di promuovere eventi pro-apoptotici ed anti-proliferativi; una sua diminuita attività comporta un aumento di segnali anti-apoptotici e proliferativi. La sua attività, come quella di ogni fosfatasi, è controbilanciata dalle protein chinasi; mentre queste ultime sono state ampiamente indagate nel corso degli anni, il ruolo di PP2A è stato preso in considerazione solo molto più di recente, e insieme ad esso è stata esplorata la possibilità di considerare l’enzima un target per farmaci. Infatti, è stato dimostrato che l’attività di PP2A è ridotta in svariate forme tumorali, in particolare leucemie e ancor più nel dettaglio nei casi di B-CLL (leucemia linfatica cronica a cellule B). Al momento, la principale ipotesi per spiegare questo fenomeno è che PP2A sia inattivata non tanto in maniera diretta, quanto piuttosto per aumentata espressione della proteina SET, suo inibitore endogeno. In questi casi, la capacità della cellula di entrare in apoptosi è fortemente compromessa, quindi la possibilità di ripristino dell’attività di PP2A è attualmente presa in considerazione come nuova, possibile terapia anti tumorale. Fingolimod (nome IUPAC 2-ammino-2-[2-(4-ottilfenil)etil]propan-1,3-diolo) è stato approvato nel 2010 per il trattamento della sclerosi multipla in forma recidivante-remitente. La sua attività è legata al fatto che, una volta internalizzato dalla cellula, esso viene fosforilato e diventa strutturalmente simile alla sfingosina-1-fosfato (S1P), mimandone l’azione sui linfociti T: sovrastimolando i recettori per S1P, infatti, Fingolimod può portare alla loro degradazione, evitando che i linfociti T possano uscire dai linfonodi e perpetrare il danneggiamento degli assoni neuronali. Più di recente, è stato dimostrato che Fingolimod può, come effetto collaterale, ristabilire nei tumori l’attività di PP2A; il meccanismo sottostante a questa attività non è stato ancora del tutto chiarito, ma sembra legato all’interazione tra Fingolimod e il complesso PP2A/SET. Curiosamente, questa funzione richiede che Fingolimod non sia fosforilato. Questo lavoro di tesi presenta la sintesi e la caratterizzazione di una libreria di analoghi di Fingolimod che vogliono isolare l’effetto pro-apoptotico da quello immunosoppressivo. Tenendo a mente che Fingolimod agisce su PP2A solo se non fosforilato, ciò significa progettare e creare molecole con caratteristiche strutturali modulate rispetto al composto preso a modello, ma con un’attenzione particolare alla loro capacità di subire fosforilazione. Questo approccio ha lo scopo di ottenere nuove, potenziali drug entities anti-cancro che possano ripristinare la capacità delle cellule interessate di subire apoptosi. I composti sono stati testati nel laboratorio della Prof. Brunati (Dipartimento di Medicina Molecolare, Università di Padova) per valutare la loro attività verso PP2A in cellule di B-CLL. In questo senso, sono stati ottenuti alcuni composti meritevoli di interesse e vengono qui riportati i risultati dei saggi biologici sul composto più attivo. Inoltre, è stato perseguito lo scopo di produrre le proteine PP2A (subunità catalitica) e SET tramite tecnica del DNA ricombinante al fine di ottenere dettagli strutturali sull’interazione tra proteine, e sulla eventuale modalità di legame tra queste e i composti sintetizzati; questa parte del progetto è stata svolta presso Diamond Light Source (UK). Il lavoro svolto getta le basi per un approfondito studio strutturale dell’interazione tra PP2A e SET (che, ad oggi, è piuttosto lacunosa), sia alla razionalizzazione delle relazioni struttura-attività tra le proteine di interesse e composti anti-neoplastici; questo potrà aiutare a chiarire le caratteristiche strutturali di cui necessitano le molecole per essere attive, e di conseguenza a progettare in modo razionalizzato analoghi di Fingolimod nuovi e migliorati.