Plant derived Sweet and Ice Structuring proteins as new tools in food processing

Tra le bioindustrie quella agroalimentare rappresenta uno dei campi più importanti di applicazione delle biotecnologie. Obiettivo di questo lavoro è la progettazione e produzione di proteine ricombinanti al fine di migliorare la qualità del cibo. La qualità può interessare diversi aspetti come ad esempio il processo di conservazione intesa come shelf-life (‘vita di scaffale’, ossia il periodo durante il quale un prodotto può essere tenuto presso un punto vendita al dettaglio senza che vengano alterate le sue qualità), le proprietà fisiche (es. colore, consistenza, sapore) e nutrizionali dell’alimento, o la possibilità di produrre cibi adatti a persone con intolleranze alimentari o con particolari malattie. Dato che un eccessivo consumo di saccarosio è implicato in varie patologie come ad esempio l’obesità, le carie e il diabete, il nostro primo tema di ricerca si è focalizzato su una proteina dolcificante non-calorica. Tra le proteine dolcificanti isolate finora, la brazzeina sembra essere la più promettente. La disponibilità limitata della fonte naturale di brazzeina ha reso economicamente non sostenibile la sua produzione su scala industriale a partire dalla fonte naturale. La tecnologia del DNA ricombinante costituisce un’alternativa praticabile e più economica per la produzione su ampia scala. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo efficiente per l’espressione inducibile o costitutiva della brazzeina nel lievito GRAS (Generally Recognized As Safe) Pichia Pastoris; circa 200 mg di brazzeina sono stati ottenuti da un volume di fermentazione pari a 1.5 litri. Abbiamo inoltre ottimizzato un processo di purificazione sicuro ed economico mediante cromatografia a scambio cationico, ottenendo la brazzeina con una purezza finale pari al 99.98 %. La proteina purificata è stata poi caratterizzata mediante divere tecniche: spettrometria di massa, analisi calorimetriche e NMR sono state effettuate per valutare rispettivamente la massa e le modifiche post-traduzionali presenti nel prodotto finale, e la stabilità termica della proteina; analisi NMR sono state effettuate anche per confermare la similarità di struttura della proteina prodotta per via ricombinante, con quella della proteina wild-type direttamente estratta dalla pianta; un saggio per determinare l’intensità del gusto dolce ci ha permesso di definire la ‘sweetness potency’ della brazzeina ricombinante; abbiamo infine analizzato il potenziale allergenico della brazzeina mediante analisi della sua sequenza amminoacidica e digestione con l’enzima gastrico pepsina. Per quanto riguarda il miglioramento della shelf-life e delle proprietà fisiche dei cibi, abbiamo concentrato la nostra attenzione su una proteina interessante per l’applicazione in prodotti surgelati. In particolare siamo interessati all’inibizione della ricristallizzazione, fenomeno che causa la formazione di grandi cristalli di ghiaccio a spese di cristalli piccoli a temperature vicine ai 0 °C. L’abilità delle ISPs (Ice Structuring Proteins; proteine che proteggono gli organismi che vivono a temperature inferiori allo zero dagli effetti deleteri della formazione di cristalli di ghiaccio nelle cellule) di inibire il fenomeno della ricristallizzazione le rende interessanti per l’industria alimentare come naturali modulatori del ghiaccio per la conservazione di prodotti surgelati come ad esempio il gelato. In particolare, è stato visto che le ISPs di pianta sono degli ottimi inibitori della ricristallizzazione del ghiaccio. Abbiamo pertanto identificato una promettente ISP di grano (Triticum aestivum) e abbiamo fatto i primi passi verso lo sviluppo di un metodo di espressione per la sua produzione a livello industriale. Al fine di effettuare degli studi preliminari abbiamo espresso la ISP in diversi ceppi di Escherichia coli, ottenendo però una piccolissima quantità di proteina ricombinante che, oltretutto, precipita nel pellet durante il processo di purificazione. Quindi, al fine di ottenere alti livelli di ISP solubile, siamo passati al sistema di espressione costitutiva in P. pastoris. La proteina è stata espressa in diverse forme: con e senza coda di istidine al C-terminale, e con e senza il fattore di secrezione α-factor di Saccharomyces cerevisiae. Grazie a esperimenti su piccola scala abbiamo determinato che solamente la proteina wild type con l’α-factor viene espressa, e che il suo peso molecolare osservato è comparabile con quello atteso. Sviluppi futuri riguarderanno lo scale-up del processo di espressione, l’ottimizzazione di un protocollo di purificazione e la caratterizzazione della proteina prodotta. Per concludere, al fine di studiare la possibile applicazione di una ISP come ingrediente nell’industria alimentare o come crioprotettore in medicina (altra possibile applicazione delle ISPs) abbiamo messo a punto un protocollo sperimentale per valutare l’attività di inibizione della ricristallizzazione e l’abilità di criopreservazione di differenti fonti di ISPs (estratto di grano, ISPs di tipo I e II di pesce).