Study of the nerve terminal regeneration in neuromuscular junction intoxicated with different presynaptic neurotoxins.

La giunzione neuromuscolare (GNM) e’ una struttura fondamentale in biologia e la sua organizzazione e’ stata recentemente complicata dall’ aggiunta delle cellule di Schwann perisinaptiche (CSP), portando al concetto di sistema tripartito. Le CSP rappresentano la glia della GNM e sono coinvolte nel suo recupero in seguito a danno. Infatti, le CSP dedifferenziano in seguito a danno al terminale nervoso (TN), rimuovono i detriti derivanti della sua degenerazione e protrudono una serie di prolungamenti che guidano la reinnervazione. Alcuni mediatori implicati nell’attivazione dell CSP sono stati individuati (es. ATP, ACh) ma noi ipotizziamo che anche l’acido arachidonico e I suoi derivati possano portare all’attivazione dell CSP. I modelli di danno al nervo usati fino ad ora forniscono un sistema non controllabile dal momento che portano alla degenerazione Walleriana, un processo degenerativo e infiammatorio. L’iniezione intramuscolare di tossine presinaptiche (α-LTX and SPANs), provocando un danno limitato al solo TN, rappresenta il nostro sistema sperimentale. Dal momento che le SPANs conducono alla degenerazione del TN mediante differenti azioni, per determinare il contributo relativo dell’influsso di Ca2+ abbiamo effettuato una comparazione con α-LTX, la quale provoca degenerazione del TN attraverso un massiccio ingresso di Ca2+. Tutti I parametri analizzati sono simili per le due classi di neurotossine. Questo indica che il sovraccarico di Ca2+ gioca un ruolo di rilievo nella degenerazione del TN indotta da SPANs. Non sono state osservate differenze nella cinetica di degenerazione/rigenerazione dei TN tra muscoli veloci (EDL) e lenti (soleo). α-LTX provoca una degenerazione sincrona in completo accordo con i dati derivanti dal saggio di funzionalita’ muscolare (saggio DAS). La degenerazione dei TN indotta da SPANs, nel caso specifico βBtx, presentano un motivo a chiazze e i dati derivati dal saggio DAS non correlano con le osservazioni immunoistologiche. Una differenza nel comportamento delle CSP e’ stato osservato tra EDL iniettati con α-LTX e denervati. Una diminuzione dell’intensita’ del segnale delle CSP marcate con S100 e’ stato osservata dopo trattamento con α-Ltx e denervazione, indicandone l’attivazione, ma non e’ stata osservata la protrusione di prolungamenti se non nei muscoli denervati. Al fine di caratterizzare meglio questo peculiare comportamento dell CSP, abbiamo esteso l’analisi ad marker di attivazione delle CSP, quali Nestina and Glial Fibrillaric Acidic Protein (GFAP). Non sono state osservate differenze tra i controlli e i campioni intossicati. Considerando che le CSP acquisiscono un’attivita’ simil-macrofagica in seguito ad attivazione e possiedono recettori in grado di individuare pattern molecolari associati a patogeni, ci siamo chiesti se peptidi formilati e DNA mitocondriale, derivanti dai mitocondri in degenerazione, possano attivare le CSP. Abbiamo provato a testare con diversi approcci la nostra ipotesi su colture primarie di cellule di Schwann ma, a causa di problemi sperimentali, i risultati non sono al momento conclusivi.